小鼠下肢诱导继发性淋巴水肿的修订方法

Summary

这种动物模型使研究人员能够诱导具有统计学意义的继发性淋巴水肿在小鼠的后肢，持续至少8周。该模型可用于研究淋巴水肿的病理生理学，并研究新的治疗方案。

Abstract

动物模型在淋巴水肿研究中至关重要，以便了解疾病的病理生理学，同时探索潜在的治疗方案。这种小鼠模型允许研究人员诱导持续至少8周的显著淋巴水肿。淋巴水肿是诱导使用分段放射治疗和手术消融淋巴。该模型要求小鼠在手术前后获得10格雷（Gy）辐射。模型的手术部分包括三个淋巴血管的结扎和从小鼠后肢提取两个淋巴结。由于小鼠的解剖结构很小，因此获得显微手术工具和显微镜至关重要。该模型的优点是，它导致统计显著淋巴水肿，这为评估不同的治疗方案提供了良好的基础。这也是一个伟大的和容易获得的显微外科培训的选择。此模型的局限性是该过程可能非常耗时，尤其是在未提前练习时。该模型在小鼠中产生客观可量化的淋巴水肿，不会引起严重的发病率，并已在三个单独的项目中进行了测试。

Introduction

淋巴水肿的特点是淋巴液的积累，导致局部组织肿胀，这主要是由于淋巴^血管1淋巴液的流动受损或中断。淋巴流可能因感染、阻塞、损伤或淋巴^系统2的先天性缺陷而受损或中断。这些病因导致淋巴液的积累，导致慢性炎症状态，导致随后的纤维化，以及脂肪组织的^沉积3。淋巴水肿可分为原发性或继发性淋巴水肿。原发性淋巴水肿是由发育异常或基因^突变2，4引起的。继发性淋巴水肿的发生是由于潜在的全身疾病，手术或^{创伤2，4。}继发性淋巴水肿是世界上最常见的淋巴水肿^形式2。在发达国家，继发性淋巴水肿最常见的病因是肿瘤治疗，如辅助放射治疗和淋巴结^解剖5。淋巴水肿是乳腺癌患者中最常见的，但也可以在妇科、黑色素瘤、泌尿生殖素或颈部癌症^{患者中发展。}有人建议，在所有被诊断患有乳腺癌的妇女中，21%会发展成淋巴水^肿7。

淋巴水肿对患者在身体和心理上都有压力。淋巴水肿患者感染的风险^{增加5、8、9，}生活质量差，可发展社会焦虑和抑郁症^症状10。慢性淋巴水肿的并发症导致高昂的护理费用和增加的疾病^{负担9，11。}研究结果还表明，淋巴水肿可能与^{乳腺癌治疗后}死亡风险增加有关。保守管理，如压缩受影响的区域，手动淋巴排水和一般护肤仍然是第一线的方法。目前尚无^治疗6。虽然在外科和医疗领域取得了进展，但仍有改进的余地。需要更多的研究，提供洞察的病理生理学和疾病的进展，是需要使临床医生提供更好的治疗选择^{的患者5。}

动物模型正用于临床前研究，以了解疾病的病理生理学，并开发潜在的治疗方案。^{在13只、14}只、^兔子15只、^绵羊16只、^{猪17只、18}只和啮^{齿动物19只、20}只，建立了几种不同的淋巴水肿动物^{模型。 21，22，23，24}.啮齿动物模型似乎是最具成本效益的模型，当研究淋巴功能的重建，由于啮齿动物容易获得和相对低^廉25。大多数小鼠模型都集中在诱导淋巴水肿在小鼠的尾巴21，22，23。尾部模型是非常可靠的，但诱导淋巴水肿的确切手术技术在以前的公开材料中变化很大。这导致在已知的淋巴水^肿25中呈现的发达淋巴水肿的持续时间和鲁棒性的波动。在后肢模型中也使用不同的技术诱导淋巴水肿，它们也产生不同的结果，但从翻译的角度来看，后肢模型可能更容易理解。以前的淋巴水肿模型一直受到自发淋巴水肿分辨率的阻碍，因此需要一个可重复的和永久淋巴水肿^模型25。研究人员此前曾试图增加辐射剂量，以防止自发淋巴水肿的分辨率，但这往往导致随后的严重^发病率。

该模型通过将显微手术与辐射相结合，在不引起严重发病率的情况下，产生具有统计学意义的淋巴水肿。该模型已由以前的手术模型修改，增加了一剂引淋巴水肿的辐照，而不会引起严重的^{发病率26。}它还为显微外科培训提供了绝佳的机会。由于小鼠的解剖结构较小，因此有必要使用显微外科设备和显微镜。当使用者被教导了基本的显微外科技术，如用显微手术器械缝合时，可以进行外科手术。执行此程序的操作员都观看了 Acland 关于显微外科技能（1981 年）和基本显微技术（1985 年）的先决条件的教程视频。我们建议在研究中使用之前，先进行8~10次的外科手术。实施该过程可确保减少错误，并更有效地执行该过程。掌握了后，手术可在45分钟内完成。

Protocol

根据机构准则，动物被安置在南丹麦大学动物照料设施中。涉及动物主体的所有程序都已获得丹麦环境和食品部动物实验监察局的批准。 1. 手术前辐照 注：手术前照射发生在手术前7天。 诱导麻醉。 将鼠标放入感应箱中，将蒸发器设置为 3% 的无氧，氧气流量为 0.8±1.2 L/min，以诱导吸入麻醉。注：或者，可以使用注射麻醉剂，但在照射的?…

Representative Results

此过程以前已在三个单独的实验中使用。所有的实验都是由不同的首席研究员进行的，他们都是本文的合著者。在所有三个实验中，都非常小心地遵循与本协议中描述的相同的程序。在所有三个实验中，继发性淋巴水肿在一个后肢诱导，而另一个后肢作为控制。后肢的体积是所有三个实验的主要结果。图 1说明了研究设计。 <p class="jove_content" fo:kee…

Discussion

此协议中有几个关键步骤。首先，研究人员在处理放射性时必须采取安全预防措施。其次，在该协议的手术部分，重要的是开始程序，一旦鼠标已被麻醉，并完成它，没有不必要的休息。这一点很重要，以避免动物的手术时间过长，并防止麻醉在手术过程中失去效果。建议只注射一次麻醉剂，一次完成手术。这也是一个关键步骤， 不要管理太多的专利蓝色 V， 因为过量的专利蓝色 V 将变色周围的…

Materials

10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture – Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator – ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad – PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer – PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder – Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V – 25 mg/ml	Guerbet
Scissors – Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation – D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic – 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment – viscotears	Bausch & Lomb