Um método revisado para induzir o linfedema secundário no hindlimb dos ratos

Summary

Este modelo animal permite que os investigadores induzam o linfedema secundário estatìstica significativo no retrospecto dos ratos, durando pelo menos 8 semanas. O modelo pode ser usado para estudar a fisiopatologia do linfedema e para investigar novas opções de tratamento.

Abstract

Os modelos animais são de suma importância na pesquisa do linfedema, a fim de compreender a fisiopatologia da doença, mas também para explorar potenciais opções de tratamento. Este modelo do rato permite que os investigadores induzam o linfedema significativo que dura pelo menos 8 semanas. O linfedema é induzido usando uma combinação de radioterapia fracionada e ablação cirúrgica de linfáticos. Este modelo exige que os ratos recebem uma dose de 10 cinza (Gy) radiação antes e depois da cirurgia. A parte cirúrgica do modelo envolve a ligadura de três vasos linfáticos e extração de dois gânglios linfáticos do membro posterior do rato. Ter acesso a ferramentas microcirúrgicas e um microscópio é essencial, devido às pequenas estruturas anatômicas dos camundongos. A vantagem deste modelo é que ele resulta em linfedema estatisticamente significativo, o que fornece uma boa base para avaliar diferentes opções de tratamento. É também uma opção grande e facilmente disponível para o treinamento microcirúrgico. A limitação deste modelo é que o procedimento pode ser demorado, especialmente se não for praticado com antecedência. O modelo resulta em linfedema objetivamente quantificável em camundongos, sem causar morbidade grave e foi testado em três projetos separados.

Introduction

O linfedema é caracterizado por um acúmulo de líquido linfático que leva ao inchaço do tecido localizado, que ocorre principalmente devido ao fluxo prejudicado ou interrompido de fluido linfático nos vasos linfáticos¹. O fluxo linfático pode ser prejudicado ou interrompido por infecção, obstrução, lesão ou defeitos congênitos no sistema linfático^2. Essas etiologias resultam em acúmulo de líquido linfático, o que leva a um estado crônico de inflamação, resultando em fibrose subseqüente, bem como a deposição do tecido adiposo³. O linfedema pode ser categorizado como linfedema primário ou secundário. O linfedema primário é causado por anormalidades no desenvolvimento ou mutação genética^2,4. O linfedema secundário ocorre devido à doença sistêmica subjacente, cirurgia ou trauma^2,4. Linfedema secundário é a forma mais comum de linfedema no mundo². Nos países desenvolvidos, a causa mais comum do linfedema secundário é a terapia oncológica, como radioterapia adjuvante e dissecção do nóde linfático⁵. O linfedema é mais frequente entre os pacientes com câncer de mama, mas também pode se desenvolver em pacientes com câncer ginecológico, melanoma, genitourinário ou pescoço⁶. Tem sido sugerido que de todas as mulheres diagnosticadas com câncer de mama, 21% desenvolverão linfedema⁷.

Linfedema pode ser estressante para o paciente física e psicologicamente. Pacientes com linfedema têm um risco aumentado de infecção^5,8,9, má qualidade de vida e podem desenvolver ansiedade social e sintomas de depressão¹⁰. As complicações do linfedema crônico levam ao alto custo dos cuidados e ao aumento da carga da doença^9,11. Os resultados também sugeriram que o linfedema pode estar associado ao aumento do risco de morte após o tratamento do câncer de mama^12. A gerência conservadora tal como a compressão da área afetada, a drenagem manual do linfa e o skincare geral permanecem a primeira aproximação da linha. Atualmente não há tratamento curativo⁶. Embora o progresso foi feito no campo da terapia cirúrgica e médica, há ainda um quarto para a melhoria. Mais pesquisa, fornecendo a introspecção na fisiopatologia e progressão da doença, é necessário permitir clínicos de fornecer melhores opções do tratamento para os pacientes^5.

Modelos animais estão sendo usados em pesquisas pré-clínicas para entender a fisiopatologia de doenças e desenvolver opções potenciais de tratamento. Vários modelos animais linfedemos diferentes foram estabelecidos em caninos^13,14,coelhos^15,ovelhas^16,porcos^17,18 e roedores^{19,20, 21,22,23,24.} O modelo de roedores parece ser o modelo mais econômico, ao investigar a reconstrução da função linfática, devido a roedores serem facilmente acessíveis e relativamente de baixo preço²⁵. A maioria dos modelos de camundongos se concentraram em induzir linfedema na cauda dos camundongos^21,22,23. O modelo da cauda é muito de confiança mas a técnica cirúrgica exata para induzir o linfedema varia significativamente no material publicado precedente. Isso resulta em flutuações de duração e robustez do linfedema desenvolvido apresentado sapateado conhecido^25. Diferentes técnicas também estão sendo usadas para induzir linfedema no modelo de membros posteriores e também produzem resultados variados, mas o modelo de membros posteriores pode ser mais fácil de entender de uma perspectiva translacional. Modelos anteriores de linfedema foram prejudicados pela resolução espontânea do linfedema e, portanto, um modelo de linfedema reproduzível e permanente é necessário²⁵. Os investigadores têm tentado previamente aumentar a dose da radiação, para impedir a definição espontânea do linfedema, mas esta conduziu frequentemente à morbosidade severa subseqüente^25.

Este modelo resulta em linfedema estatisticamente significativo, sem causar morbidade grave, combinando microcirurgia com radiação. O modelo foi revisado a partir de um modelo cirúrgico anterior, adicionando uma dose de irradiação que induz o linfedema, sem causar morbidade grave²⁶. Ele também oferece uma grande oportunidade para o treinamento microcirúrgico. É necessário ter acesso a equipamentos microcirúrgicos e microscópio, devido às pequenas estruturas anatômicas dos camundongos. O procedimento cirúrgico pode ser realizado quando o usuário foi ensinado técnicas microcirúrgicas básicas, como a sutura com instrumentos microcirúrgicos. Os operadores que realizaram este procedimento assistiram a vídeos tutoriais de Acland sobre as pré-condições de habilidades microcirúrgicas (1981) e técnica de microssutura básica (1985). Recomendamos a prática do procedimento cirúrgico 8 a 10 vezes antes de usá-lo em pesquisa. A prática do procedimento garante que menos erros sejam cometidos e que o procedimento possa ser realizado de forma mais eficiente. Quando dominado, o procedimento cirúrgico pode ser realizado em 45 minutos.

Protocol

Os animais foram alojados na Universidade do Sul da Dinamarca Animal Care Facility de acordo com as orientações institucionais. Todos os procedimentos que envolvem indivíduos animais foram aprovados pela Inspecção de Experiências Animais, Ministério do Ambiente e Alimentação da Dinamarca. 1. Irradiação pré-cirurgia NOTA: A irradiação pré-cirurgia ocorre 7 dias antes da cirurgia. Induzir anestesia. Coloque o mouse em uma caixa de indu…

Representative Results

Este procedimento foi usado previamente em três experiências separadas. Todos os experimentos foram feitos por diferentes investigadores principais que todos são co-autores deste artigo. Em todos os três experimentos, foi tomado grande cuidado para aderir ao mesmo procedimento descrito neste protocolo. Em todos os três experimentos, o linfedema secundário foi induzido em um membro posterior, enquanto o outro membro posterior serviu como controle. Os volumes dos membros posteriores f…

Discussion

Há alguns passos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, é importante que os pesquisadores tomem precauções de segurança ao trabalhar com radioatividade. Em segundo lugar, durante a parte cirúrgica deste protocolo, é importante iniciar o procedimento uma vez que o rato tenha sido anestesiado e terminá-lo sem pausas desnecessárias. Isso é importante para evitar um período cirúrgico excessivamente longo para o animal e evitar que a anestesia perca efeito durante a cirurgia. Recomenda-se administrar apenas…

Materials

10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture – Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator – ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad – PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer – PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder – Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V – 25 mg/ml	Guerbet
Scissors – Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation – D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic – 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment – viscotears	Bausch & Lomb