Un metodo rivisto per indurre il linfomal secondario nell'Hindlimb dei topi
Summary
Questo modello animale consente ai ricercatori di indurre linfedema secondario statisticamente significativo nell’arto posteriore dei topi, della durata di almeno 8 settimane. Il modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia del linfedema e per studiare nuove opzioni di trattamento.
Abstract
I modelli animali sono di fondamentale importanza nella ricerca del linfedema per comprendere la fisiopatologia della malattia, ma anche per esplorare le potenziali opzioni di trattamento. Questo modello murino consente ai ricercatori di indurre linfedema significativo della durata di almeno 8 settimane. Il linfodatama viene indotto utilizzando una combinazione di radioterapia frazionata e ablazione chirurgica dei linfatici. Questo modello richiede che i topi ottono una dose di radiazioni da 10 Gray (Gy) prima e dopo l’intervento chirurgico. La parte chirurgica del modello prevede la legatura di tre linfatici e l’estrazione di due linfonodi dall’arto posteriore del topo. Avere accesso a strumenti microchirurgici e un microscopio è essenziale, a causa delle piccole strutture anatomiche dei topi. Il vantaggio di questo modello è che si traduce in linfedema statisticamente significativo, che fornisce una buona base per valutare diverse opzioni di trattamento. È anche una grande e facilmente disponibile opzione per l’allenamento microchirurgico. La limitazione di questo modello è che la procedura può richiedere molto tempo, soprattutto se non praticata in anticipo. Il modello si traduce in linfedema oggettivamente quantificabile nei topi, senza causare grave morbilità ed è stato testato in tre progetti separati.
Introduction
Il linfedema è caratterizzato da un accumulo di fluido linfatico che porta al gonfiore del tessuto localizzato, che si verifica principalmente a causa di un flusso alterato o interrotto del fluido linfatico nei vasi linfatici1. Il flusso linfatico può essere alterato o interrotto da infezione, ostruzione, lesioni o difetti congeniti nel sistema linfatico2. Queste eziologie provocano l’accumulo di liquido linfatico, che porta ad uno stato cronico di infiammazione, con conseguente successiva fibrosi, così come la deposizione del tessuto adiposo3. Il linfedema può essere classificato come linfedema primario o secondario. Il linfedema primario è causato da anomalie dello sviluppo omutazionegenetica 2,4. Linfedema secondario si verifica a causa della malattia sistemica sottostante, chirurgia o trauma2,4. Il linfedema secondario è la forma più comune di linfedema nel mondo2. Nei paesi sviluppati, la causa più comune del linfedema secondario è la terapia oncologica come la radioterapia adiuvante e la dissezione dei linfonodi5. Il linfedema è più frequente tra i pazienti affetti da cancro al seno, ma può anche svilupparsi in pazienti con ginecologia, melanoma, cancro genitourinario o al collo6. È stato suggerito che su tutte le donne diagnosticate con cancro al seno, il 21% svilupperà il linfedema7.
Il linfodema può essere stressante per il paziente sia fisicamente che psicologicamente. I pazienti con linfedema hanno un aumentato rischio di infezione5,8,9, scarsa qualità della vita e possono sviluppare ansia sociale e sintomi di depressione10. Le complicazioni del linfedema cronico portano ad un alto costo delle cure e ad un aumento del carico di malattia9,11. I risultati hanno anche suggerito che il linfedema potrebbe essere associato ad un aumento del rischio di morte dopo il trattamento del cancro al seno12. La gestione conservativa come la compressione dell’area interessata, il drenaggio manuale della linfa e la cura generale della pelle rimangono il primo approccio di linea. Attualmente non esiste un trattamento curativo6. Anche se sono stati fatti progressi nel campo della terapia chirurgica e medica, c’è ancora spazio per migliorare. Sono necessarie ulteriori ricerche, che forniscono informazioni sulla fisiopatologia e la progressione della malattia, per consentire ai medici di fornire migliori opzioni di trattamento per i pazienti5.
I modelli animali vengono utilizzati nella ricerca preclinica per comprendere la fisiopatologia delle malattie e sviluppare potenziali opzioni di trattamento. Diversi modelli animali di linfedema sono stati stabiliti in canini13,14, conigli15, pecore16, maiali17,18 e roditori19,20, 21,22,23,24. Il modello dei roditori sembra essere il modello più conveniente, quando si studia la ricostruzione della funzione linfatica, a causa della facilità accessibili dei roditori e relativamente a basso prezzo25. La maggior parte dei modelli di topi si sono concentrati sull’indurre linfedema nella coda dei topi21,22,23. Il modello di coda è molto affidabile, ma l’esatta tecnica chirurgica per indurre il linfedema varia in modo significativo nel materiale pubblicato in precedenza. Ciò si traduce in fluttuazioni di durata e robustezza del linfedema sviluppato presentato in litterature noto25. Diverse tecniche vengono utilizzate anche per indurre linfedema nel modello dell’arto posteriore e producono anche risultati variabili, ma il modello dell’arto posteriore potrebbe essere più facile da capire da una prospettiva traslazionale. Precedenti modelli di linfedema sono stati ostacolati dalla risoluzione spontanea del linfedema e quindi è necessario un modello di linfedema riproducibile e permanente25. I ricercatori hanno già cercato di aumentare la dose di radiazioni, per prevenire la risoluzione spontanea del linfedema, ma questo ha spesso portato a successiva grave morbilità25.
Questo modello si traduce in linfedema statisticamente significativo, senza causare grave morbilità, combinando microchirurgia con radiazioni. Il modello è stato rivisto da un precedente modello chirurgico aggiungendo una dose di irradiazione che induce il linfedema, senza causare grave morbilità26. Offre anche una grande opportunità per l’allenamento microchirurgico. Avere accesso a apparecchiature microchirurgiche e un microscopio è necessario, a causa delle piccole strutture anatomiche dei topi. La procedura chirurgica può essere eseguita quando all’utente sono state insegnate tecniche microchirurgiche di base, come la sutura con strumenti microchirurgici. Gli operatori che hanno eseguito questa procedura tutti guardato video tutorial da Acland sui presupposti di abilità microchirurgiche (1981) e tecnica di microsutura di base (1985). Si consiglia di praticare la procedura chirurgica 8-10 volte prima di utilizzarlo nella ricerca. La pratica della procedura garantisce che vengano commessi meno errori e che la procedura possa essere eseguita in modo più efficiente. Quando masterizzato, la procedura chirurgica può essere eseguita in 45 minuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono alcuni passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, è importante che i ricercatori prendano precauzioni di sicurezza quando lavorano con la radioattività. In secondo luogo, durante la parte chirurgica di questo protocollo, è importante iniziare la procedura una volta che il mouse è stato anetizzato e finirlo senza interruzioni inutili. Questo è importante per evitare un periodo chirurgico eccessivamente lungo per l’animale e per evitare che l’anestesia perda effetto durante l’intervento chirurgico….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Peter Bollen, capo del Laboratorio Biomedico per aver prestato le attrezzature necessarie per registrare le riprese viste attraverso i microscopi.
Materials
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture – Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator – ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad – PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer – PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder – Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V – 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors – Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation – D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic – 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment – viscotears | Bausch & Lomb |
Referências
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K., Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. , 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment?. Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H. The psycho-social impact of lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 7 (2), 109-112 (2009).
- Gutknecht, M., et al. Cost-of-illness of patients with lymphoedema. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 31 (11), 1930-1935 (2017).
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs’ limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O’Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats’ limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research–a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
