Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Индукция эриптоза в клетках красных кровяных клеток с использованием ионофора кальция

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/60659
Automatic Translation
1, 1,2
1Biomedical Engineering Program, Ohio University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University

Summary

Предусмотрен протокол индукции эриптоз, запрограммированный клеточной смерти в эритроцитах, с использованием ионофора кальция, иономицина. Успешный эриптоз оценивается путем мониторинга локализации фосфатидилсерина во мембранной внешней листовке. Были изучены факторы, влияющие на успешность протокола, и обеспечены оптимальные условия.

Abstract

Эриптоз, эритроцит запрограммированной клеточной смерти, возникает при ряде гематологических заболеваний и при травме эритроцитов. Отличительной чертой эриптотических клеток является потеря композиционной асимметрии клеточной мембраны, что приводит к транслокации фосфатидилсерина в мембранную внешнюю листовку. Этот процесс вызван повышенной внутриклеточной концентрацией Ca2 ,который активирует скремблаз, фермент, который облегчает двунаправленное движение фосфолипидов между мембранными листовками. Учитывая важность эриптоз в различных заболеваний, были предприняты усилия, чтобы вызвать эриптоз в пробирке. Такие усилия, как правило, опирались на ионофор кальция, иономицин, для повышения внутриклеточной концентрации Ca2 "и вызвать эриптоз. Тем не менее, многие расхождения были зарегистрированы в литературе в отношении процедуры индуцирования эриптоз с использованием иомамицина. В этом мы сообщаем о поэтапном протоколе для иономицина индуцированного эриптозва в эритроцитах человека. Мы фокусируемся на важных шагах в процедуре, включая концентрацию ионофора, время инкубации и истощение глюкозы, и обеспечиваем репрезентативный результат. Этот протокол может быть использован для воспроизводимого индуцирования эриптоза в лаборатории.

Introduction

Запрограммированная гибель клеток в эритроцитах, также известных как эриптоз, распространена во многих клинических условиях и гематологических расстройствах. Eryptosis связано с усадкой клеток и потерей фосфолипидной асимметрии в мембране плазмы клетки1,2. Потеря асимметрии приводит к транслокации фосфатидилсерина (PS), липида, обычно локализуемого во внутренней листовке3,4, к клеточной внешней листовке, которая сигнализирует макрофагам на фагоциты и удаляет дефектные эритроциты5,6,7,8. В конце нормальной продолжительности жизни эритроцитов удаление эриптотических клеток макрофагами обеспечивает баланс эритроцитов в обращении. Однако, в болезненных условиях, таких как серповидно-клеточная болезнь и талассемия9,10,11, повышенный эриптоз может привести к тяжелой анемии2. Из-за его важности в гематологических заболеваний, существует значительный интерес к изучению факторов, вызывающих или ингибирующих эриптоб и молекулярных механизмов, лежащих в основе этого процесса.

Плазменная мембрана здоровых эритроцитов асимметрична, с различными фосфолипидами, локализующихся на наружных и внутренних листовках. Мембранная асимметрия в первую очередь регулируется действием мембранных ферментов. Аминофосфолипид транслокс облегчает транспортировку аминофосфолипидов, PS и фосфатидиэтаноламин (ПЭ), направляя эти липиды на клеточной внутренней листовке. С другой стороны, флоппас транспортирует холин, содержащий фосфолипиды, фосфатидилхолин (ПК) и сфингомиелин (СМ), от внутренней к внешней листовке клеточной мембраны12. Однако, в отличие от здоровых клеток, мембрана эритроцитов скремблируется. Это связано с действием третьего фермента, скремблаза, который нарушает фосфолипидную асимметрию, облегчая двунаправленный перенос аминофосфолипидов13,14,15,16. Scramblase активируется повышенными внутриклеточными уровнями Ca2 . Таким образом, ионофоры кальция, которые облегчают транспортировку Ca2 "через клеточную мембрану12, являются эффективными индукторами эриптоса.

Иономицин, ионофор кальция, широко используется для индуцирования эриптоза в эритроцитах12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Иономицин имеет как гидрофильные, так и гидрофобные группы, которые необходимы для связывания и захвата иона Ca2 и транспортировать его в цитозолическое пространство27,28,29. Это приводит к активации скремблаза и транслокации PS на внешнюю листовку, которая может быть легко обнаружена с помощью приложения-V, клеточного белка с высоким сродством к PS12. Хотя запуск эриптоза иомамицином обычно сообщается, есть значительное расхождение метода в литературе (Таблица 1). Популяция эритроцитов, проходящих эриптоз, зависит от различных факторов, таких как концентрация ионофора, время лечения ионофором, а также содержание сахара в внеклеточной среде (истощение глюкозы активирует каналы катионов и облегчает вхождение Ca2 в цитозоликическое пространство)30,31. Тем не менее, есть мало последовательности в этих факторов в литературе, что затрудняет выполнение эриптоза воспроизводимо in vitro.

В этом протоколе мы представляем пошаговую процедуру, чтобы вызвать эритроциты человека. Учитываются факторы, влияющие на успешный эрипток, включая концентрацию Ca2, концентрацию ионофора, время лечения и предварительное инкубацию в глюкозно-обеденный буфер и сообщается об оптимальных значениях. Эта процедура показывает, что прединкубация эритроцитов в буфере без глюкозы значительно увеличивает процент эриптоза по сравнению с глюкозосодержащим буфером. Этот протокол может быть использован в лаборатории для производства эриптотических эритроцитов для различных применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все образцы крови человека, использованные в описанном ниже протоколе, были приобретены в качестве деидентифицированных образцов. Ни один человек не был непосредственно вовлечен или набран для этого исследования. Руководящие принципы Хельсинкской декларации должны использоваться в том случае, если исследования затрагивают людей.

1. Эритроцитная изоляция от цельной крови

  1. Добавьте 500 л цельной крови в кислотную цитрат декстрозу (ACD) (хранящуюся при 4 градусах Цельсия) в микроцентрифугную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся кровь была приобретена в ACD. По данным компании, к 7 мл цельной крови добавляется 1,5 мл ACD (общий объем 8,5 мл).
  2. Centrifuge всю кровь на 700 х г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) и удалить прозрачная плазма и тонкий шафлы пальто с помощью пипетки, чтобы оставить красный слой эритроцита.
  3. Подготовьте 1 l раствора Ringer, содержащего 125 мм NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgSO4,32 мМ HEPES, 5 мм глюкозы и 1 мМ CaCl2. Отрегулируйте рН до 7,4, добавив 2 капли на 1,0 МН. Чтобы подготовить без глюкозное решение Ringer, следуйте тому же протоколу, но не включайте глюкозу в раствор.
  4. Вымойте эритроциты 2x в растворе Ringer, приостановив клеточные гранулы в 1,5 мл раствора Ringer, центрифугируя при 700 х г в течение 5 мин на РТ, и удалив супернатант.
  5. Сделайте 0,4% гематокрит, отодвинив 40 л гранул эритроцита в 9960 л раствора Ringer без глюкозы, чтобы достичь конечного объема 10 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гематокрит это термин, используемый для обозначения объема фракции эритроцитов в подвеске. Гематокрит 0,4% - это суспензия, содержащая 0,4% эритроцитов.
  6. Инкубировать суспензию клетки при 37 градусах По Цельсию в течение 7 дней.

2. Лечение эритроцитов иономицином и измерение гемолиза

  1. Растворите 1 мг иономицина соли кальция в 630 л диметилсульксида (ДМСО) для достижения конечной концентрации в 2 мМ. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
  2. Возьмите 1 мл гематокрит 0,4% со ступени 1,5 и добавьте 0,5 л 2 ММ иомомицина, чтобы достичь конечной концентрации 1 м/м. Инкубировать 2 ч при 37 градусах Цельсия.
    1. Используйте 1 мл гематокрит без лечения иономицином в качестве отрицательного контроля.
  3. Centrifuge иономицин лечения и необработанных гематократов на 700 х г в течение 5 минут на RT, и удалить их супернатанты, чтобы оставить клетки гранулы в нижней части труб.
  4. Вымойте клетки 3x с ringer раствор, подвенив клеточные гранулы в 1,5 мл раствора Ringer, центрифугирование на 700 х г в течение 5 минут на RT и отбрасывая супернатанты.
  5. Для измерения гемолиза добавьте 1 мл необработанного 0,4% гематокрита от ступени 1,5 до микроцентрифуговой трубки и инкубируют в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия в качестве отрицательного контроля гемолиза (0%).
  6. Добавьте 1 мл необработанного 0,4% гематокрита от шага 1,5 до микроцентрифуги трубки и центрифуги при 700 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и добавьте 1 мл дистиллированной воды в пеллету клетки и инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах по Цельсию в качестве положительного контроля при гемолизе (100%).
  7. Добавьте 1 мл обработанного иомицина 0,4% гематокрита от ступени 2.2 до микроцентрифуговой трубки.
  8. Центрифуги необработанных клеток, обработанных клеток, и клетки в дистиллированной воде на 700 х г в течение 5 мин на RT.
  9. Возьмите 200 л супернатантов и добавьте в 96-колодую пластину.
  10. Измерьте абсорбцию на уровне 541 нм с помощью микроплитного считывателя.
  11. Рассчитайте гемолиз с помощью уравнения 132:

    %Гемолиз(A T - A0)/(A100 -0)

    где A0 является поглощение эритроцитов в растворе Ringer, A100 является поглощение эритроцитов в воде, иA T является поглощение обработанных эритроцитов иономицином.

3. Привязка Annexin-V

  1. Разбавить 2 мл 5x annexin V связывающий буфер в 8 мл фосфат-буферного солева (PBS) для получения 1x связывающего буфера.
  2. Отрежь иономицин-обработанные и необработанные гранулы клетки от шага 2.4 в 1 mL 1x связывающем буфера.
  3. Возьмите 235 qL клеточных суспензий в связывающем буфере и добавьте 15 зл и конъюгированной муки Annexin V-Alexa.
  4. Инкубировать клетки на RT в течение 20 минут в темном месте. Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин на RT и удалить супернатант.
  5. Вымойте клетки 2x с 1x связывающий буфер, приостановив клетки гранулы в 1,5 мл связывающего буфера, центрифугирование на 700 х г в течение 5 минут на RT и удаление супернатанта.
  6. Повторите пеллеты клеток в 250 л 1x связывающего буфера для измерения цитометрии потока.

4. Цитометрия потока

  1. Передача 200 зл иэрроцитов аннексии-V в 1 мл круглых нижних полистироловых труб, совместимых с цитометрией потока.
  2. Войти в поток цитометрии программного обеспечения и нажмите на новую кнопку эксперимента. Нажмите на новую кнопку трубки. Выберите глобальный лист и выберите анализ применения для измерения интенсивности флуоресценции с длиной волн возбуждения 488 нм и длиной волны выбросов 530 нм.
  3. Установите количество ячеек до 20 000, которые будут собраны для анализа сортировки клеток, активированных флуоресценцией (FACS).
  4. Выберите нужную трубку и нажмите на кнопку нагрузки. Нажмите на кнопку записи для измерения рассеяния вперед и бокового рассеяния. Повторите для всех образцов.
  5. Нажмите правой кнопкой «Образец» и нажмите на применить пакетный анализ для создания файла результата.
  6. Нажмите правой кнопкой «Образец» и нажмите на генерацию файлов FSC.
  7. Добавьте данные цитометрии потока (файлы FSC) на рабочее место программного обеспечения цитометрии потока.
  8. Проанализируйте контрольные данные, выбрав интересующую группу клеток и добавив статистику стоимости эриптобиса.
    1. Дважды нажмите на контроль и выберите гистограмму против интенсивности флуоресценции.
    2. Нажмите на кнопку ворот, чтобы нарисовать ворота на гистограмме, которая указывает процент эриптоза.
  9. Применить ту же статистику для всех других экспериментальных труб для получения значений эриптоз. Нажмите право йняж на элемент управления и выберите анализ копий в группу.
  10. После правильного удаления всех образцов перенесите проанализированные данные путем перетаскивания и сброса их в редактор макета.
    1. Накладывайте анализируемые данные с помощью управления в редакторе макета.
    2. Установите желаемые гистограммы и интенсивности, изменив ось x и y накладных графиков.
    3. Экспорт файлы изображений, нажав на кнопку экспорта и сохранить графики в нужном месте.

5. Конфокальная микроскопия

  1. Передача 5 Зл аннексии-V-окрашенных клеток на слайд микроскопа и покрыть его крышкой скольжения. Хранить в темном месте, чтобы предотвратить фотоотбеление.
  2. Используйте аргонный лазер конфокального флуоресцентного микроскопа для наблюдения за клетками, возбужденными при 488 нм с желаемыми увеличениями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальный микроскоп не обязательно нужен, и любой микроскоп с возможностями флуоресценции может быть использован для получения флуоресценции изображения, которые демонстрируют привязки annexin-V.
  3. Получайте флуоресценцию изображения контрольных (необработанных клеток) и обработанных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные клетки, как ожидается, показывают очень слабые сигналы флуоресценции, в то время как обработанные клетки, как ожидается, показывают ярко-зеленую флуоресценцию на их мембранах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оптимизация концентрации иомицина

В то время как иономицин необходим для индуцирования эриптоза, увеличение концентрации иомицина может привести к гемолизу (т.е. лизозу эритроцитов и высвобождению гемоглобина), чего необходимо избегать. Лечение эритроцитов с 1 мкм иомамицина в растворе Ringer в течение 2 ч достаточно, чтобы вызвать эриптоз, о чем свидетельствует успешная маркировка с приложением-V Alexa Flour 488 конъюгированных и количественной оценки анализа FACS(Рисунок 1A). Более высокие концентрации иономицина (5 и 10 мкм) приводят к незначительному увеличению эриптоза(рисунок 1A-D). Тем не менее, такие концентрации также усиливают гемолизиз(рисунок 1E), который не является желательным. Для того, чтобы оставаться ниже 5% гемолиза, 1 ММ иомамицин должен быть использован.

Время лечения иономицином

Инкубация эритроцитов с иономицином в растворе Ringer всего за 30 мин достаточна для того, чтобы вызвать эриптоз(рисунок 2А). Увеличенное время инкубации увеличивает уровень эриптоза, как измеряется пристройки V-связывающей асссс, до 2 ч(рисунок 2B,C). Однако дальнейшее время инкубации приводит к незначительному снижению уровня эриптоза(рисунок 2D). Максимальный эриптоз был получен после 2 ч лечения 1 мкм иомамицином, а для всех других периодов лечения был получен более низкий эриптоз(рисунок 2E). Представитель потока цитометрических гистограмм представлены на рисунке 2A-D. Кроме того, средний процент эриптоз и гемолиз, для различных раз лечения с 1 ММ иомомицин, представлены на рисунке 2E и Рисунок 2F, соответственно. Более высокое значение гемолиза после 180 мин объясняет снижение эриптоз после того же количества инкубации(Рисунок 2E), как менее жизнеспособные клетки существуют на 180 мин лечения иономицина.

Кроме того, клетки лечились с низкими концентрациями иомамицина, включая 0, 0,25, 0,5 и 1 мкм для более длительного времени лечения, включая 6 и 12 ч, и был измерен эриптоз(рисунок 3). Клетки, обработанные концентрацией иомицина ниже, что 1 ММ для 6 и 12 ч показывают более низкий эриптоз по сравнению с клетками, обработанными 1 ММ иомамицин(Рисунок 3). Поскольку снижение концентрации и увеличение времени воздействия не усиливало эриптоз, 1 ММ был использован для вызвать эриптоб.

Эриптоз зависит от времени инкубации и внеклеточной концентрации глюкозы

Концентрация внеклеточной глюкозы влияет на исход процесса. Более высокие значения эриптознаблюдается когда erythrocytes pre-incubated в глюкоз-свободном растворе Ringer сравненный к глюкоз-содержащему раствору Ringer перед инкубации с 1 иономицином м/ММ для 2 h. Самые высокие значения эриптобиса приобретаются после 7 дней предварительной инкубации в обоих решениях. Тем не менее, эриптоб выше после предварительной инкубации в безглюкозном растворе Ringer по сравнению с обычным раствором Ringer, который содержит глюкозу 5 мМ (см. рисунок 4А для репрезентативных участков и рисунок 4В для сравнения глобальных средств). Кроме того, вперед рассеяния гистограммы указывают на влияние истощения глюкозы на сокращение эритроцитов(рисунок 5A-D). Передний рассеяние является мерой для размера ячейки на основе преломления света, и уровень рассеянного света прямо пропорционален размеру ячеек33. Клетки, инкубированные в растворе Ringer без глюкозы, показывают меньше переднего рассеяния по сравнению с клетками, инкубированными в глюкозосодержащем буфере(Рисунок 5E),что указывает на усадку клеток в среде, свободной от глюкозы.

В дополнение к измерениям цитометрии потока, клетки наблюдались под конфокальный флуоресцентный микроскоп для подтверждения эриптоз. Erythrocytes без лечения(Рисунок 6A) и с иономицином лечения(рисунок 6B) были помечены приложением-V Alexa муки 488 конъюгированных и наблюдается под микроскопом. Обработанные клетки показали яркий сигнал флуоресценции(рисунок 6B) из-за связывания приложения-V к PS во внешней листовке. В отличие от этого, клетки без лечения показали очень слабый сигнал флуоресценции(Рисунок 6А), указывающий на очень низкий уровень эриптоза. Далее пример изображения эритроцитов эритроцитов, помеченных аннексией-V с высоким флуоресценцией, показаны на рисунке 6C.

Figure 1
Рисунок 1: Представительные графики влияния различных концентраций иомицина на эриптоз и гемолиз. Поток цитометрических гистограмм эритроцитов, обработанных с помощью (A) 1 мкм, (B) 5 мкм, и (C) 10 мкм иомамицин (серый) при 37 КК при 0,4% гематокрита в растворе Рингер в течение 2 ч. Черная линия указывает на необработанные клетки. Процент эриптоза указан в каждой цифре. Фосфатидилсерин воздействия был измерен с помощью присоединения annexin-V. (D) Арифметические средства SD (n no 3) процентного эриптоза клеток, обработанных с различными концентрациями иономицина после 2 ч лечения, и (Е) арифметические средства SD (n no 3) гемолиза эритроцитов различными концентрациями иомамицина в тех же условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные данные о влиянии различных раз лечения иономицина на эриптоз. Поток цитометрии гистограммы эритроцитов, обработанных 1 мкм иономицин (серый) при 37 кв с для (A) 30 мин, (B) 60 мин, (C) 120 мин, и (D) 180 мин при 0,4% гематокрит в растворе Ringer. Черная линия указывает на необработанные клетки. Процент эриптоза указан в каждой цифре. Фосфатидилсерин воздействия измеряется с помощью присоединения приложения-V. (E) Арифметические средства SD (n no 3) процентного эриптоза клеток, обработанных 1 мкм иомамицин в разное время. Самый высокий эриптоб был получен после 120 мин лечения. (F) Арифметические средства SD (n no 3) процентного гемолиза клеток, обработанных 1 мкм иомамицином в разное время. Для статистического анализа была проведена односторонняя непараметрическая ANOVA с тестом Крускал-Валлис, а эриптоз после 120 мин лечения был значительно выше, чем контроль, как указано в панели E. - для p qlt; 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние различных концентраций иономицина и времени лечения на эриптоз. Арифметические средства SD (n no 3) процентного эриптоза клеток, обработанных с различными концентрациями иономицина показано после различных времен лечения. Клетки лечились с низкими концентрациями иомамицина, включая 0, 0,25, 0,5 и 1 мкм для более длительного воздействия (6 ч и 12 ч). Более высокие концентрации и более длительные процедуры привели к более высоким значениям эриптобов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Влияние истощения энергии на эриптоз. (A) Поток цитометрической гистограммы для эритроцитов, обработанных 1 мкм иомамицин (серый) при 37 кс для 2 ч при 0,4% гематокрита, после предварительного инкубации в растворе Ringer без глюкозы (верхние фигуры) и растворе Ringer (нижние фигуры) от 1 до 7 дней, показывает, что истощение энергии облегчает эриптоз. Черная линия указывает на необработанные клетки. Проценты эриптоза указаны в графиках за каждый день. (B) Арифметические средства SD (n no 3) процентного эриптоза эритроцитов, обработанных 1 мкм иомамицином при 37 кв. м на 2 ч при 0,4% гематокрит, после предварительной инкубации в растворе Ringer (черные полосы) и без глюкозы Ringer раствор (белые полосы) от 1 до 7 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Влияние истощения энергии на размер клеток. Вперед рассеять гистограмму для эритроцитов, обработанных 1 мкм иомамицином при 37 градусах по Цельсию при 2 ч при 0,4% гематокрита, после предварительного инкубации в растворе без глюкозы Ringer (серый) и растворе Ringer (черная линия) для (A) 1 день, (B) 3 дня, (C) 5 дней, и ( (D) 7 дней. Вперед рассеяния гистограмма с течением времени указывает на сокращение эритроцитов в буфере без глюкозы. (E) Арифметические средства SD (n no 3) интенсивности переднего рассеяния эритроцитов, обработанных 1 мкм иомамицином при 37 КК в течение 2 ч при 0,4% гематокрика, после предварительной инкубации в растворе Ringer (черные полосы) и без глюкозы Ringer раствор (белые полосы) от 1 до 7 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Конфокальная флуоресцентная микроскопия изображения эритроцитов, обработанных (A) 0 мкм, (B) и (C) 1 зМ иомамицин при 37 КК для 2 ч при 0,4% гематокрит. 40x объективное увеличение было использовано для изображений в панелях A и B, и 100x объективное увеличение было использовано для того чтобы принять изображения для панели C. PS в здоровых erythrocytes расположено на внутренне листовке мембраны клетки, поэтому никакой сигнал fluorescence в панели A. В панелях B и C эритроциты были индуцированы для эриптоза и есть яркий сигнал флуоресценции в результате связывания приложения-V к PS транслокации на внешней листовке клеточной мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Плотность клеток /гематокрит Концентрация иономицина Буфера Предварительная инкубация Время лечения иономицином Метод обнаружения Ссылки
1.65 x 108 ячеек/мл 0,3 мм Буфер АЗ 36 ч в буфере А 1 ч Аннексин V 12
0.40% 1 мМ Решение Ringer 48 ч в Рингер 1 ч Аннексин V 17
50% 10 мМ Буфер Бе - 3 ч Мероцианин 540 18
0.40% 1 мМ Решение Ringer 48 ч в Рингер 1 ч Аннексин V 19
0.40% 1 мМ Решение Ringer 48 ч в Рингер 1 ч Аннексин V 20
2% 1 мМ Решение Ringer - 4 ч Аннексин V 21
0.40% 1 мМ Решение Ringer - 0,5 ч Аннексин V 22
10% 1 мМ Решение Ringer - 3 ч Аннексин V 23
0.40% 10 мМ Решение Ringer - 0,5 ч Аннексин V 24
0.40% 1 мМ Решение Ringer 48 ч в Рингер 0,5 ч Аннексин V 25
2 x 106 ячеек/мл 1 мМ HEPES-буферный солен (HBS) - 0,5 ч Аннексин V 26
«Буфер A: 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 5 мм KCl, 1 мМ МГК26H2O, 10 мм глюкозы, и 1,8 мм CaCl22H2O
Буфер B: 5 мм Трис, 100 мМ KC1, 60 мМ NaCl, и 10 мм глюкозы

Таблица 1: Различные протоколы, используемые в литературе, чтобы вызвать эриптоз с использованием иономицина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Целью данной процедуры является обеспечение оптимальных значений концентрации ионофора, времени лечения и внеклеточной концентрации глюкозы, которые являются важными факторами обеспечения успешной индукции эриптобиа. Важным шагом в протоколе является истощение внеклеточной глюкозы, которая, несмотря на свою важность, недостаточно подчеркнута в литературе. Содержание сахара в обычном растворе Ringer (5 мМ) оказывает ингибирующее действие на эриптоб. Истощение глюкозы во внеклеточной среде вызывает клеточный стресс и активирует протеиновый киназа С (PKC), что приводит к активации кальций и калийных каналов. Это приводит к увеличению ввода Ca2 "в цитозлого пространства30,31,34 и в конечном итоге активирует скремблаз16, что увеличивает эриптоз. Активация калийного канала также приводит к утечке хлористого калия из клетки, что приводит к усадке эритроцита35.

Процедура, изложенная выше, должна быть выполнена с особым вниманием к гемолизам. Важно использовать оптимизированную концентрацию ионофора, которая достаточно высока, чтобы вызвать эриптоб, и достаточно низка, чтобы предотвратить гемолиз. Аналогичным образом, инкубация эритроцитов с иономицином в течение короткого периода времени приводит к низкому эриптоза, в то время как очень длительная инкубация может привести к нарушению клеточной мембраны и гемолиза. Следует также отметить, что в то время как представленный протокол является очень надежным при выполнении на том же образце эритроцита, клетки разных людей по-разному реагируют на иомамицин и может быть межсубъектная изменчивость между различными образцами.

Особое внимание следует уделить анализу данных с цитометрии потока. Процент эриптоз, полученный из цитометра потока, указывает процент популяции клеток с PS на их внешней листовке. Однако клетки с разной интенсивностью привязки приложения-V нельзя отличить на основе этого числа. Annexin-V связывается с PS подвергаются на поверхности клетки, с очень высоким сродством и высокой специфичностью для PS36,37,38. Однако, как показано на микроскопических изображениях в этом докладе, различные клетки показывают различия в интенсивности связывания приложения-V. Клетки с низким PS на их мембранах имеют низкую интенсивность флуоресценции, тогда как более высокое заполняемость PS на мембране клетки приводит к более высокой интенсивности флуоресценции.

Протокол, представленный в настоящем документе, может быть изменен за счет увеличения внеклеточной концентрации Ca2. В этом протоколе, иомицин был использован для индуцирования эриптоз в присутствии 1 мМ CaCl2; более высокие концентрации Ca2 "может привести к повышению уровня внутриклеточного кальция и может вызвать больше эриптоза. Кроме того, различные ионофоры кальция, такие как селемофор и кальцимицин, могут иметь различную способность для повышения внутриклеточной концентрации Ca2 ",по сравнению с иономицином, и может привести к различным значениям эриптоза. Тем не менее, последовательный эриптоз эритроцитов может быть достигнуто с помощью иономицина с изложенным протоколом и может быть использован в лаборатории для изучения молекулярных механизмов эриптоз, мимические заболевания39,40в пробирке, и экран потенциальных терапевтических препаратов, которые подавляют эриптоз, среди других приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом NIH R15ES030140 и грантом NSF CBET1903568. Подтверждена также финансовая поддержка со стороны Русского инженерно-технологического колледжа и кафедры химической и биомолекулярной инженерии Университета Огайо.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).

Tags

Биохимия выпуск 155 эритроцит эриптоз фосфатидилсерин аннексия V иомоницин клеточная мембрана
Индукция эриптоза в клетках красных кровяных клеток с использованием ионофора кальция
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bigdelou, P., Farnoud, A. M.… More

Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter