Quantification du lixiviation des métaux dans la chromatographie d'affinité métallique immobilisée
Summary
Nous présentons un analyse pour la quantification facile des métaux introduits aux échantillons préparés utilisant la chromatographie immobilisée d’affinité de métal. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol comme indicateur de métal colorimétrique et un spectrophotomètre UV-Vis comme détecteur.
Abstract
La contamination des enzymes avec des métaux lessiminés à partir de chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) colonnes pose une préoccupation majeure pour les enzymologues, comme beaucoup de cations communes di-et trivalents utilisés dans les résines IMAC ont un effet inhibiteur sur les enzymes. Cependant, l’étendue du lessivage des métaux et l’impact de divers réactifs d’éluetation et de réduction sont mal compris en grande partie en raison de l’absence de protocoles simples et pratiques de quantification des métaux de transition qui utilisent l’équipement habituellement disponible dans laboratoires de biochimie. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un protocole pour quantifier rapidement la quantité de contamination des métaux dans les échantillons préparés à l’aide de l’IMAC comme étape de purification. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol (HNB) comme indicateur colorimétrique de la teneur en cation métallique dans une solution d’échantillon et la spectroscopie UV-Vis comme moyen de quantifier la quantité de métal présent, dans la gamme nanomolaire, basée sur le changement du spectre HNB à 647 nm. Bien que la teneur en métaux d’une solution ait toujours été déterminée à l’aide de la spectroscopie d’absorption atomique ou de techniques plasmatiques couplées inductivement, ces méthodes nécessitent un équipement spécialisé et une formation en dehors du champ d’application d’un laboratoire de biochimie typique. La méthode proposée ici fournit un moyen simple et rapide pour les biochimistes de déterminer la teneur en métaux des échantillons en utilisant l’équipement et les connaissances existants sans sacrifier la précision.
Introduction
Depuis sa création par Porath et ses collègues1, la chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) est devenue une méthode de choix pour séparer rapidement les protéines en fonction de leur capacité à se lier avec des ions métalliques de transition tels que Zn2 ,Ni2 ,Cu2, et Co2. Ceci est le plus souvent fait par l’intermédiaire des étiquettes de poly-histidine machinées et est maintenant l’une des techniques de purification chromatographique les plus communes pour l’isolement des protéines recombinantes2. IMAC a également trouvé des applications au-delà de la purification des protéines recombinantes comme un moyen d’isoler les quinolones, tétracyclines, aminoglycosides, macrolides, et les lactams pour l’analyse des échantillons alimentaires3 et comme une étape dans l’identification des marqueurs de protéines du sérum sanguin pour les cancers du foie et du pancréas4,5. Sans surprise, IMAC est également devenu une méthode de choix pour l’isolement d’un certain nombre d’enzymes bioénergétiques indigènes6,7,8,9,10. Cependant, la mise en œuvre réussie de ces méthodes de purification pour des études sur les protéines bioénergétiques enzymatiquement actives dépend de la présence de niveaux négligeables de cations métalliques lixiviées de la matrice de colonne dans l’éluate. Les cations métalliques divalentes couramment utilisées dans l’IMAC ont connu une signification biologique pathologique, même à de faibles concentrations11,12. L’effet physiologique de ces métaux est plus prononcé dans les systèmes bioénergétiques, où ils peuvent s’avérer mortels comme inhibiteurs de la respiration cellulaire ou de la photosynthèse13,14,15. Des problèmes similaires sont inévitables pour la majorité des classes de protéines où les métaux résiduels contaminants peuvent interférer avec les fonctions biologiques d’une protéine ou la caractérisation avec des techniques biochimiques et biophysiques.
Alors que les niveaux de contamination des métaux dans des conditions oxydantes et en utilisant l’imidazole comme éluant sont généralement faibles16, les isolements protéiques effectués en présence d’agents de réduction de la cystéine (TNT, mercaptoéthanol, etc) ou avec des chélateurs plus forts comme l’histidine17,18 ou l’acide éthylediaminetetraacetic (EDTA) se traduisent par des niveaux beaucoup plus élevés de contamination métallique19,20. De même, puisque les ions métalliques dans les résines IMAC sont fréquemment coordonnés par des groupes carboxyliques, les élutions protéiques effectuées dans des conditions acides sont également susceptibles d’avoir des niveaux beaucoup plus élevés de contamination des métaux. La teneur en métaux dans les solutions peut être évaluée à l’aide de la spectroscopie d’absorption atomique (AAS) et de la spectrométrie de masse plasmatique couplée inductive (ICP-MS) jusqu’à une limite de détection dans la gamme ppb-ppt21,22,23,24. Malheureusement, l’AAS et l’ICP-MS ne sont pas des moyens réalistes de détection dans un laboratoire de biochimie traditionnel, car ces méthodes nécessiteraient l’accès à de l’équipement spécialisé et à la formation.
Les travaux antérieurs de Brittain25,26 ont étudié l’utilisation du bleu hydroxynaphthol (HNB) comme un moyen d’identifier la présence de métaux de transition dans la solution. Cependant, il y avait plusieurs contradictions internes dans les données20 et ces travaux n’offrait pas un protocole adéquat. Des études de Temel et coll.27 et Ferreira etcoll. 28 ont porté sur le travail de Brittain avec HNB en tant qu’indicateur métallique potentiel. Cependant, Temel a développé un protocole qui utilise aAS pour l’analyse de l’échantillon, en utilisant HNB seulement comme un agent de chélage. L’étude de Ferreira a utilisé le changement des spectres d’absorption de HNB à 563 nm, une région des spectres HNB à colorant libre qui chevauche fortement les spectres des complexes hNB-métal au pH 5.7, ce qui rend la sensibilité d’analyse assez faible et a entraîné une affinité de liaison métallique relativement faible20. Pour résoudre les problèmes dans notre propre laboratoire avec Ni 2 ‘lixiviation de l’IMAC, nous avons élargi le travail effectué par Brittain25, 26 et Ferreria28 pour développer un test facile capable de détecter les niveaux de nanomolar de plusieurs métaux de transition. Nous avons montré que HNB lie le nickel et d’autres métaux communs pour IMAC avec des affinités de liaison sous-nanomolaires et la forme 1:1 complexe sur un large éventail de valeurs de pH20. L’analyse rapportée ici est basée sur ces résultats et utilise des changements d’absorption dans le spectre HNB à 647 nm pour la quantification des métaux. L’analyse peut être effectuée dans la plage de pH physiologique à l’aide de tampons et d’instruments communs trouvés dans un laboratoire de biochimie typique en utilisant la détection colorimétrique et la quantification des complexes de teinture métallique et le changement associé dans l’absorption du colorant libre lorsqu’il se lie au métal.
Protocol
Representative Results
Discussion
La détection colorimétrique des métaux à l’aide de HNB fournit un moyen simple de quantifier le degré de contamination des protéines par les ions métalliques de transition provenant des résines IMAC. Comme nous l’avons établi dans l’arbitre 20, Ni2 s’associe à HNB avec 1:1 stoichiométrie et la constante de dissociation pour le complexe Ni-HNB change avec le pH. Cependant, le complexe Kd est dans la gamme sous-nM pour toutes les valeurs recommandées (7-12) pH. Concrètement, cela signifie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par la National Science Foundation sous la fondation Grant MCB-1817448 et par un prix du Thomas F. et Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Trustee et donateur spécifié Hazel Thorpe Carman et George Gay Carman Confiance.
Materials
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
Referências
- Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
- Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).
- Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).
- Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).
- Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).
- Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).
- Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).
- Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).
- Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).
- Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).
- Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).
- Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Bioquímica. 40 (6), 1850-1860 (2001).
- Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).
- Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).
- Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
- Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
- Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
- Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. . Inorganic Chemical Biology. , (2014).
- Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
- Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).
- Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).
- Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).
- Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).
- Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).
- Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).
- Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
- Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).
- Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).
- Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8 (4), 127 (2017).
- Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).
