Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada

Summary

Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.

Abstract

La contaminación de enzimas con metales lixiviados a partir de columnas de cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas (IMAC) plantea una preocupación importante para los enzimólogos, ya que muchos de los cationes di y trivalentes comunes utilizados en las resinas IMAC tienen un efecto inhibitorio sobre las enzimas. Sin embargo, el alcance de la lixiviación de metales y el impacto de varios reactivos de elución y reducción se entienden mal en gran parte debido a la ausencia de protocolos de cuantificación de metales de transición simples y prácticos que utilizan equipos típicamente disponibles en laboratorios de bioquímica. Para abordar este problema, hemos desarrollado un protocolo para cuantificar rápidamente la cantidad de contaminación metálica en muestras preparadas utilizando IMAC como paso de purificación. El método utiliza el azul hidroxinaphthol (HNB) como indicador colorimétrico para el contenido de catión de metal en una solución de muestra y la espectroscopia UV-Vis como medio para cuantificar la cantidad de metal presente, en el rango nanomolar, basado en el cambio en el espectro HNB a 647 nm. Mientras que el contenido de metal en una solución se ha determinado históricamente utilizando espectroscopia de absorción atómica o técnicas de plasma acoplado inductivamente, estos métodos requieren equipos especializados y entrenamiento fuera del alcance de un laboratorio de bioquímica típico. El método propuesto aquí proporciona una manera sencilla y rápida para que los bioquímicos determinen el contenido de metal de las muestras utilizando el equipo y el conocimiento existentes sin sacrificar la precisión.

Introduction

Desde sus inicios por Porath y sus compañeros de trabajo¹, la cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) se ha convertido en un método de elección para separar rápidamente las proteínas en función de su capacidad de unirse con iones metálicos de transición como Zn^2+,Ni^2+,Cu²⁺y Co^2+. Esto se hace más comúnmente a través de etiquetas de polihistidina de ingeniería y ahora es una de las técnicas de purificación cromatográfica más comunes para el aislamiento de proteínas recombinantes². IMAC también ha encontrado aplicaciones más allá de la purificación de proteínas recombinantes como una forma de aislar quinolonas, tetraciclinas, aminoglucósidos, macrólidos y lactams para el análisis de muestras de alimentos³ y como un paso en la identificación de marcadores de proteínas de suero sanguíneo para cánceres de hígado y páncreas^4,5. No es de extrañar que IMAC también se haya convertido en un método de elección para el aislamiento de una serie de enzimas bioenergéticas nativas^6,7,8,9,10. Sin embargo, la implementación exitosa de estos métodos de purificación para estudios sobre proteínas bioenergéticas enzimáticamente activas depende de la presencia de niveles insignificantes de cationes metálicos lixiviados de la matriz de columna en el eluido. Los cationes metálicos divalentes comúnmente utilizados en IMAC han conocido significación biológica patológica, incluso a bajas concentraciones^11,12. El efecto fisiológico de estos metales es más pronunciado en los sistemas bioenergéticos, donde pueden resultar letales como inhibidores de la respiración celular o fotosíntesis^13,14,15. Problemas similares son inevitables para la mayoría de las clases de proteínas donde los metales contaminantes residuales pueden interferir con las funciones biológicas de una proteína o la caracterización con técnicas bioquímicas y biofísicas.

Mientras que los niveles de contaminación de metales en condiciones oxidantes y el uso de imidazol como eluyente son típicamentebajos¹⁶, los aislamientos proteicos realizados en presencia de agentes reductores de cisteína (TDT, é-mercaptoetanol, etc.) o con queladores más fuertes como la histidina^17,18 o ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) dan como resultado niveles mucho más altos de contaminación metálica^19. Del mismo modo, dado que los iones metálicos en las resinas IMAC son frecuentemente coordinados por grupos carboxílicos, también es probable que las eluciones de proteínas realizadas en condiciones ácidas tengan niveles mucho más altos de contaminación metálica. El contenido de metal en soluciones se puede evaluar utilizando espectroscopía de absorción atómica (AAS) y espectrometría de masas plasmáticas acopladas inductivamente (ICP-MS) hasta un límite de detección en el rango ppb-ppt^21,22,23,24. Desafortunadamente, AAS y ICP-MS no son medios realistas para la detección en un laboratorio de bioquímica tradicional, ya que esos métodos requerirían acceso a equipos especializados y capacitación.

Trabajo anterior de Brittain^25,26 investigó el uso de azul hidroxinaphthol (HNB) como una manera de identificar la presencia de metales de transición en solución. Sin embargo, hubo varias contradicciones internas en los datos²⁰ y esas obras no ofrecieron un protocolo adecuado. 27 y Ferreira et al.²⁸ ampliaron el trabajo de Brittain con HNB como un indicador de metal potencial. Sin embargo, Temel desarrolló un protocolo que hace uso de AAS para el análisis de muestras, utilizando HNB sólo como agente quelante. El estudio de Ferreira utilizó el cambio en los espectros de absorbancia HNB a 563 nm, una región de los espectros HNB de tinte libre que se superpone en gran medida con los espectros de complejos de metal HNB a pH 5.7, haciendo que la sensibilidad del ensayo sea bastante baja, así como dando como resultado una afinidad de unión de metales relativamente débil^20. Para abordar problemas en nuestro propio laboratorio con Ni²⁺ lixiviación de IMAC, hemos ampliado el trabajo realizado por Brittain^25,26 y Ferreria²⁸ para desarrollar un ensayo fácil capaz de detectar niveles nanomolares de varios metales de transición. Mostramos que HNB une níquel y otros comunes para los metales IMAC con afinidades de unión sub-nanomolar y forma 1:1 complejo en una amplia gama de valores de pH²⁰. El ensayo aquí indicado se basa en estos hallazgos y utiliza cambios de absorbancia en el espectro HNB a 647 nm para la cuantificación de metales. El ensayo se puede realizar en el rango de pH fisiológico utilizando tampones e instrumentación comunes que se encuentran en un laboratorio de bioquímica típico mediante la detección colorimétrica y cuantificación de complejos de tinte metálico y el cambio asociado en la absorbancia del tinte libre cuando se une al metal.

Protocol

1. Preparación de componentes de ensayo Determinar las fracciones de cromatografía que se deben ensayo utilizando absorbancia óptica a 280 nm o métodos alternativos de cuantificación de proteínas para identificar las fracciones enriquecidas con proteínas.NOTA: Para este trabajo, utilizamos un espectrofotómetro UV-Vis de matriz de diodos. Para aumentar el rendimiento, se puede utilizar un lector de placas capaz de medir la absorbancia UV-Vis. Preparación de los componentes de ensayo necesa…

Representative Results

El espectro de HNB libre a pH neutro (línea negra) y espectros representativos de fracciones saysaying para Ni2+ desde el aislamiento de MSP1E3D129 se muestran en la Figura 2. Una serie de ensayos exitosa debe demostrar una disminución de la absorbancia a 647 nm en comparación con el control HNB, que corresponde a la formación de complejos HNB en presencia de un metal de transición. Un ensayo fallido se indicaría mediante un aumento de la absorbancia …

Discussion

La detección colorimétrica de metales mediante HNB proporciona una forma sencilla de cuantificar el grado de contaminación de proteínas mediante la transición de iones metálicos de resinas IMAC. Como establecimos en la Ref. 20, Ni^{2+ se} une a HNB con estequiometría 1:1 y la constante de disociación para los cambios complejos de Ni-HNB con pH. Sin embargo, el complejo K_d está en el rango sub-nM para todos los valores de pH recomendados (7-12). En términos prácticos, significa que todos los …

Materials

2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500