Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems
Summary
Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.
Abstract
Das Dot/Icm-Sekretionssystem von Legionella pneumophila ist eine komplexe Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS)-Nanomaschine, die am Bakteriellen Pol lokalisiert und die Lieferung von Protein- und DNA-Substraten an Zielzellen vermittelt, ein Prozess, der in der Regel einen direkten Zell-zu-Zell-Kontakt erfordert. Wir haben vor kurzem die Struktur des Dot/Icm-Apparats mittels Kryo-Elektronentomographie (Cryo-ET) gelöst und gezeigt, dass es einen Zellhüllen-Spannkanal bildet, der sich mit einem zytoplasmatischen Komplex verbindet. Die Anwendung von zwei komplementären Ansätzen, die die native Struktur der Probe erhalten, die fluoreszierende Mikroskopie in lebenden Zellen und Kryo-ET, ermöglicht die in situ-Visualisierung von Proteinen und die Assimilation der Stoiterminatrie und das Timing der Produktion jeder Maschinenkomponente im Vergleich zu anderen Dot/Icm-Untereinheiten. Um die Anforderungen an die polare Positionierung zu untersuchen und dynamische Merkmale im Zusammenhang mit der T4SS-Maschinenbiogenese zu charakterisieren, haben wir ein Gen kodiert, das superfolder green fluorescent protein zu Dot/Icm ATPase-Genen an ihren nativen Positionen auf dem Chromosom kodiert. Die folgende Methode integriert die quantitative Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen und Kryo-ET, um polare Lokalisation, Dynamik und Struktur dieser Proteine in intakten Bakterienzellen zu quantifizieren. Die Anwendung dieser Ansätze für die Untersuchung der Legionella pneumophila T4SS ist nützlich für die Charakterisierung der Funktion des Dot/Icm-Systems und kann angepasst werden, um eine Vielzahl von bakteriellen Krankheitserregern zu untersuchen, die die T4SS oder andere Arten von bakteriellen Sekretionskomplexen nutzen.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), das ätiologische Mittel der Legionärskrankheit, bewohnt Süßwasserreservoirs, in denen sich die Bakterien vermehren, indem sie sich in aquatischen, freischwimmenden Protozoen animieren. L. pneumophila verursacht Krankheitsausbrüche beim Menschen, wenn das Einatmen von aerosolisierten Bakterien aus Trinkwasserquellen auftritt. In infizierten Zellen ermöglicht die Subversion von Wirtswegen L. pneumophila, die endozytische Reifung des Vakuums, in dem es sich befindet, zu verzögern und die Biogenese eines Zellfachs zu fördern, das die bakterielle Replikation unterstützt. Dieser Prozess wird durch ein spezialisiertes bakterielles Sekretionssystem des Typs IVB (T4BSS) angetrieben, das als Dot/Icm bekannt ist, und seinem Repertoire von über 300 “Effektor”-Proteinen, die während der Infektion in den Wirtcytosol transloziert werden, um die Manipulation der Zellfunktionen1,2,3,4,5zu erleichtern. Mutanten ohne funktionelles Dot/Icm-Gerät liefern keine Effektoren in das Wirtszytosol, sind defekt für die intrazelluläre Replikation und sind in Tiermodellen der Krankheit6,7aviär.
Viele Bakterienarten haben extrem komplexe und dynamische Mehrkomponenten-Maschinen entwickelt, die für Infektionsprozesse benötigt werden. Andere T4BSS wie das Dot/Icm-System sind auch wichtig für die intrazelluläre Replikation von bakteriellen Krankheitserregern wie Coxiella burnetii und Rickettsiella grylli. Obwohl T4BSS evolutionär mit prototypischen IVA-Systemen des Typs verwandt sind, die DNA-Übertragung vermitteln und ein begrenztes Repertoire an Effektorproteinen liefern können, verfügt das Dot/Icm-System über fast doppelt so viele Maschinenkomponenten und liefert eine Vielzahl von Effektoren. Vermutlich hat diese Erweiterung der Anzahl der Komponenten es dem Dot/Icm-Gerät ermöglicht, neue Effektoren einfach unterzubringen und zu integrieren8,9.
Kürzlich haben wir die Kryo-Elektronen-Tomographie (Cryo-ET) verwendet, um die Struktur des Dot/Icm-Geräts in situ zu lösen und zeigten, dass es einen Zellhüllen-Spannkanal bildet, der sich mit einem zytoplasmatischen Komplex verbindet. Weitere Analysen ergaben, dass der zytosolische ATPase DotB durch Wechselwirkungen mit dem zytosolischen ATPase DotO mit dem Dot/Icm-System am L. pneumophila-Zellpol assoziiert. Wir haben entdeckt, dass DotB eine zytosolische Bewegung in den meisten Bakterienzellen zeigt, was darauf hindeutet, dass diese ATPase in einer dynamischen zytosolischen Population vorhanden ist, aber auch mit den polaren Dot/Icm-Komplexen assoziiert wird. Darüber hinaus bildet DotO eine hexamerische Baugruppe von DotO-Dimeren, die mit dem inneren Membrankomplex verbunden sind, und ein DotB-Hexamer verbindet sich mit der Basis dieses zytoplasmatischen Komplexes. Die Montage des DotB-DotO-Energiekomplexes erzeugt einen zytoplasmatischen Kanal, der die Translokation von Substraten durch das T4SS leitet (Abbildung 1)10.
Trotz dieser jüngsten Fortschritte ist wenig darüber bekannt, wie das Dot/Icm-System funktioniert und wie sich jedes Protein zu einem aktiven Apparat zusammenfügt8. Die Aufdeckung der regulatorischen Schaltungen des Dot/Icm T4SS ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen. Daher besprechen wir, wie man mit Live-Zellmikroskopie und Kryo-ET wesentliche L. pneumophila Dot/Icm-Systemkomponenten erkennt und charakterisiert, die mit Super-Ordner GFP (sfGFP) markiert sind. Mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie wird die polare Lokalisation von DotB in einem Wildtyp-Hintergrund oder beim Löschen des Typ-IV-Systems definiert. Die Zeitraffermikroskopie wird verwendet, um Unterschiede in lokalisierung und Dynamik zwischen den zytosolischen AtPases Dot/Icm zu quantifizieren.
Die kombinierte Anwendung von zwei sich ergänzenden Ansätzen wie Live Imaging und Kryo-ET bietet einen Vorteil gegenüber anderen In-vitro-Systemen. Beide Methoden werden in intakten Zellen durchgeführt und erhalten die natürliche Umgebung des T4BSS, wodurch Störungen der nativen Struktur während der Probenvorbereitung minimiert werden. Da die Überexpression von Proteinen die Stoiiometrie des Sekretionsapparates beeinträchtigen kann, werden sfGFP-Fusionen über allelischen Austausch an das Legionella-Chromosom zurückgegeben, so dass jede Fusion in einer Kopie kodiert ist und die Expression vom endogenen Promotor angetrieben wird. Die Visualisierung chromosomal-kodierter Fusionen ermöglicht die Quantifizierung des genauen Proteinniveaus, das zu einem definierten Zeitpunkt exprimiert wird. Cryo-ET hat auch viele Vorteile bei der Bestimmung der Struktur von Sekretionssystemen. Der bemerkenswerteste Vorteil ist, dass Kryo-ET-Proben aus gefrorenen intakten Zellen bestehen, die native Komplexe im Kontext der bakteriellen Zellarchitektur bewahren. Daher kann Kryo-ET biochemischen Reinigungsansätzen vorzuziehen sein, die Membrankomplexe extrahieren und periphere Proteine aus dem Kernapparat entfernen oder die Gesamtstruktur verändern können. Darüber hinaus fügt die Kennzeichnung eines von Interesse sindden Proteins mit einem sperrigen Protein wie sfGFP eine Masse hinzu, die durch Cryo-ET nachweisbar ist und bei der Kartierung der verschiedenen Unterkomplexe des Dot/Icm-Geräts auf die durch Cryo-ET erhaltene Struktur helfen kann.
Dieser Ansatz ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um strukturelle Informationen über multimolekulare Komplexe aufzudecken, die sich in der bakteriellen Zellmembran zusammensetzen. Die Interpretation von Strukturen, die mit diesen Techniken aufgeklärt werden, wird dem Feld helfen zu verstehen, wie T4BSS-Komponenten funktionieren, warum so viele Komponenten für die Funktion benötigt werden, wie die Komponenten innerhalb des größeren Komplexes interagieren und welche Funktionen diese Unterbaugruppen ausführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Aufklärung der Funktionen bakterieller Sekretionssysteme ist der Schlüssel zu einem vollständigen Verständnis der Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen. Sekretionssysteme sind komplexe Maschinen, die Effektorenproteine in Wirtszellen injizieren können und in einigen Fällen die Etablierung einer subzellulären Nische fördern, die die bakterielle Replikation unterstützt. Die obige Methode bietet wichtige neue Werkzeuge für die Untersuchung des Dot/Icm-Sekretionssystems des reinspiratorischen bakteriellen Erregers <e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. und C.R.R. wurden vom NIH (R37AI041699 und R21AI130671) unterstützt. D.P., B.H. und J.L wurden von den National Institutes of Health (R01AI087946 und R01GM107629) unterstützt.
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
Referências
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