A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema de secreção Dot/ICM da pneumophila Legionella é uma nanomáquina complexa do sistema de secreção tipo IV (T4SS) que localiza no pólo bacteriano e media a entrega de substratos de proteína e DNA às células-alvo, um processo que geralmente requer contato direto entre células. Recentemente, resolvemos a estrutura do aparelho Dot/Icm por tomografia crio-elétron (crio-ET) e mostramos que ele forma um canal de abrangência de envelopes de células que se conecta a um complexo citoplasmático. A aplicação de duas abordagens complementares que preservam a estrutura nativa do espécime, a microscopia fluorescente em células vivas e crio-ET, permite a visualização in situ de proteínas e assimilação da estequiometria e tempo de produção de cada componente da máquina em relação a outras subunidades do Ponto/Icm. Para investigar os requisitos para o posicionamento polar e para caracterizar características dinâmicas associadas à biogênese da máquina T4SS, fundimos uma proteína fluorescente verde de codificação de genes de superpasta para genes Dot/Icm ATPase em suas posições nativas no cromossomo. O método a seguir integra a microscopia quantitativa de fluorescência de células vivas e crio-ET para quantificar a localização polar, a dinâmica e a estrutura dessas proteínas em células bacterianas intactas. A aplicação dessas abordagens para o estudo da Legionella pneumophila T4SS é útil para caracterizar a função do sistema Dot/Icm e pode ser adaptada para estudar uma grande variedade de patógenos bacterianos que utilizam o T4SS ou outros tipos de complexos de secreção bacteriana.
Introdução
Legionella pneumophila (L. pneumophila), o agente etiológico da doença dos Legionários, habita reservatórios de água doce, onde as bactérias se propagam infectando e replicando dentro de protozoários aquáticos de natação livre. L. pneumophila causa surtos de doenças em humanos quando ocorre inalação de bactérias aerossolizadas de fontes de água potável. Nas células infectadas, a subversão das vias hospedeiras permite que a L. pneumophila atrase a maturação endocítica do vacúolo em que reside e promova a biogênese de um compartimento celular que suporta a replicação bacteriana. Este processo é conduzido por um sistema especializado d....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos envolvendo o crescimento, manipulação e imagem de L. pneumophila devem ser realizados em um laboratório de segurança biológica nível 2 em conformidade com as diretrizes locais.
1. Inserção de sfGFP no Cromossomo L. pneumophila utilizando a Estratégia de Troca Adélia e Dupla Seleção(Figura 2, Figura 3)
- Clone no vetor de substituição genética pSR47S11 a seguinte seqüência: a 1.000 bp upstream do local de interesse, depois a seqüência sfGFP, em seguida, a 1.000 bp downstream do site de interesse
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A recombinação homólogo com dupla seleção em duas etapas foi utilizada para construir a inserção definida do sfGFP. Na primeira etapa, foi realizado o acasalamento triparental, onde o plasmídeo conjugado pRK600 (um plasmid IncP) da cepa auxiliar E. coli MT616 foi mobilizado para o doador E. coli cepa com o vetor suicida pSR47S contendo o gene sfGFP ladeado pelas duas regiões homólogas, a origem da transferência oriT e o bacillus subseleção genética Em seguida, o sistema de conjugação d.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Elucidar as funções dos sistemas de secreção bacteriana é a chave para uma compreensão completa das interações hospedeira-patógena. Os sistemas de secreção são máquinas complexas que podem injetar proteínas de efeitos em células hospedeiras, e em alguns casos promovem o estabelecimento de um nicho subcelular que suporta a replicação bacteriana. O método acima fornece novas ferramentas importantes para estudar o sistema de secreção Dot/ICM do patógeno respiratório Legionella pneumophila, dando pistas sobre os mec.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
D.C. e C.R.R. foram apoiados pelo NIH (R37AI041699 e R21AI130671). D.P., B.H., e J.L foram apoiados pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01AI087946 e R01GM107629).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Partículas de ouro coloidal de 10 nm | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objetiva (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Carvão ativado | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, baixo ponto de fusão | AB00981 | bioanalítica americana | |
| Ágar desidratado Bacto | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz câmera digital monocromática | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µ L | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Grade de carbono R 2/1 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Nitrato de ferro (III) nonahidratado | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Câmera Summit para cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cisteína | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Lâminas de cobertura de microscópio 22x22 mm | Fisher Lâminas | 12-542B | |
| 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Lâminas para microscópio 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Motor de luz Spectra X | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher | ||
| BD | 212750 |
Referências
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
