Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM
Summary
A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.
Abstract
O sistema de secreção Dot/ICM da pneumophila Legionella é uma nanomáquina complexa do sistema de secreção tipo IV (T4SS) que localiza no pólo bacteriano e media a entrega de substratos de proteína e DNA às células-alvo, um processo que geralmente requer contato direto entre células. Recentemente, resolvemos a estrutura do aparelho Dot/Icm por tomografia crio-elétron (crio-ET) e mostramos que ele forma um canal de abrangência de envelopes de células que se conecta a um complexo citoplasmático. A aplicação de duas abordagens complementares que preservam a estrutura nativa do espécime, a microscopia fluorescente em células vivas e crio-ET, permite a visualização in situ de proteínas e assimilação da estequiometria e tempo de produção de cada componente da máquina em relação a outras subunidades do Ponto/Icm. Para investigar os requisitos para o posicionamento polar e para caracterizar características dinâmicas associadas à biogênese da máquina T4SS, fundimos uma proteína fluorescente verde de codificação de genes de superpasta para genes Dot/Icm ATPase em suas posições nativas no cromossomo. O método a seguir integra a microscopia quantitativa de fluorescência de células vivas e crio-ET para quantificar a localização polar, a dinâmica e a estrutura dessas proteínas em células bacterianas intactas. A aplicação dessas abordagens para o estudo da Legionella pneumophila T4SS é útil para caracterizar a função do sistema Dot/Icm e pode ser adaptada para estudar uma grande variedade de patógenos bacterianos que utilizam o T4SS ou outros tipos de complexos de secreção bacteriana.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), o agente etiológico da doença dos Legionários, habita reservatórios de água doce, onde as bactérias se propagam infectando e replicando dentro de protozoários aquáticos de natação livre. L. pneumophila causa surtos de doenças em humanos quando ocorre inalação de bactérias aerossolizadas de fontes de água potável. Nas células infectadas, a subversão das vias hospedeiras permite que a L. pneumophila atrase a maturação endocítica do vacúolo em que reside e promova a biogênese de um compartimento celular que suporta a replicação bacteriana. Este processo é conduzido por um sistema especializado de secreção de tipo bacteriano IVB (T4BSS) conhecido como Ponto/Icm e seu repertório de mais de 300 proteínas “eficazes” que são translocadas no citosol hospedeiro durante a infecção para facilitar a manipulação das funções celulares1,2,3,4,5. Mutantes sem um aparelho funcional Dot/Icm não conseguem entregar os efeitos no citosol hospedeiro, são defeituosos para replicação intracelular e são aviudores em modelos animais da doença6,7.
Muitas espécies bacterianas desenvolveram máquinas multicomponentes extremamente complexas e dinâmicas que são necessárias para processos de infecção. Outros T4BSS como o sistema Dot/Icm também são essenciais para a replicação intracelular de patógenos bacterianos como Coxiella burnetii e Rickettsiella grylli. Embora o T4BSS esteja evolutivamente relacionado aos sistemas iva do tipo prototípico, que mediam a transferência de DNA e podem fornecer um repertório limitado de proteínas eficazes, o sistema Dot/Icm tem quase o dobro de componentes da máquina e fornece uma grande variedade de efeitos. Presumivelmente, essa expansão no número de componentes permitiu que o aparelho Dot/Icm acomodasse e integrasse facilmente novos efeitos8,9.
Recentemente usamos a tomografia crio-elétron (crio-ET) para resolver a estrutura do aparelho Dot/Icm in situ e mostramos que ele forma um canal de abrangência de envelopes de células que se conecta a um complexo citoplasmático. Análises posteriores revelaram que o citosolicatat ATPase DotB associa-se ao sistema Dot/Icm no pólo celular L. pneumophila através de interações com o citosolicatATPase DotO. Descobrimos que o DotB apresenta um movimento citosólico na maioria das células bacterianas, indicando que este ATPase está presente em uma população citossólica dinâmica, mas também se associa aos complexos polares do Dot/Icm. Além disso, DotO forma uma montagem hexamérica de dimers DotO associados com o complexo de membrana interna, e um Hexamer DotB se junta à base deste complexo citoplasmático. A montagem do complexo energético DotB-DotO cria um canal citoplasmático que direciona a translocação de substratos através do T4SS (Figura 1)10.
Apesar desses avanços recentes, pouco se sabe sobre como funciona o sistema Ponto/Icm e como cada proteína se reúne para formar um aparelho ativo8. Descobrir os circuitos regulatórios do Ponto/Icm T4SS é fundamental para compreender os mecanismos moleculares das interações hospedeira-patógena. Portanto, discutimos como usar a microscopia de células vivas e crio-ET para detectar e caracterizar componentes essenciais do sistema L. pneumophila Dot/Icm que são marcados com a super pasta GFP (sfGFP). Utilizando microscopia quantitativa de fluorescência, a localização polar do DotB será definida em um tipo de fundo selvagem ou quando o sistema tipo IV for excluído. A microscopia de lapso de tempo será usada para quantificar diferenças na localização e dinâmica entre os ATPas citosolic do TT/ICM.
A aplicação combinada de duas abordagens complementares, como imagem ao vivo e crio-ET, proporciona uma vantagem em comparação com outros sistemas in vitro. Ambos os métodos são realizados em células intactas e preservam o ambiente natural do T4BSS, minimizando assim a interrupção da estrutura nativa durante a preparação da amostra. Como a superexpressão das proteínas pode prejudicar a estequiometria do aparelho de secreção, as fusões sfGFP são devolvidas através da troca alélica ao cromossomo Legionella para que cada fusão seja codificada em cópia única e a expressão seja conduzida pelo promotor endógeno. A visualização de fusões codificadas cromossomicamente permite quantificação do nível exato de proteína sendo expressa em um ponto de tempo definido. O Cryo-ET também tem muitas vantagens para determinar a estrutura dos sistemas de secreção. A vantagem mais notável é que as amostras crio-ET são compostas de células intactas congeladas que preservam complexos nativos no contexto da arquitetura celular bacteriana. Consequentemente, o crio-ET pode ser preferível às abordagens de purificação bioquímica, que extraem complexos de membrana e podem retirar proteínas periféricas do aparelho central ou modificar a estrutura geral. Além disso, a marcação de uma proteína de interesse com uma proteína volumosa como o sfGFP adiciona uma massa que é detectável pelo crio-ET e pode auxiliar no mapeamento dos diferentes subcomplexos do aparelho Dot/Icm na estrutura obtida pelo crio-ET.
Esta abordagem é uma poderosa ferramenta para descobrir informações estruturais sobre complexos multimoleculares que se reúnem na membrana celular bacteriana. A interpretação das estruturas elucidadas usando essas técnicas ajudará o campo a entender como funcionam os componentes T4BSS, por que tantos componentes são necessários para a função, como os componentes interagem dentro do complexo maior e quais funções esses subconjuntos funcionam.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elucidar as funções dos sistemas de secreção bacteriana é a chave para uma compreensão completa das interações hospedeira-patógena. Os sistemas de secreção são máquinas complexas que podem injetar proteínas de efeitos em células hospedeiras, e em alguns casos promovem o estabelecimento de um nicho subcelular que suporta a replicação bacteriana. O método acima fornece novas ferramentas importantes para estudar o sistema de secreção Dot/ICM do patógeno respiratório Legionella pneumophila, dan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. e C.R.R. foram apoiados pelo NIH (R37AI041699 e R21AI130671). D.P., B.H., e J.L foram apoiados pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01AI087946 e R01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
Referências
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