Screening och identifiering av RNA-ljuddämpningssuppressorer från utsöndrade effektdämpare av växtpatogener
Summary
Här presenterar vi en modifierad screeningmetod som i stor utsträckning kan användas för att snabbt screena RNA-ljuddämpande suppressorer i växtpatogener.
Abstract
RNA tysta är en evolutionärt bevarad, sekvens-specifik gen reglering mekanism i eukaryoter. Flera växtpatogener har utvecklatproteiner med förmågan att hämma värdväxten RNA-ljuddämpningsvägen. Till skillnad från virus effekteller proteiner, endast flera utsöndras effekt eller proteiner har visat förmåga att undertrycka RNA ljuddämpning i bakteriella, oomycete och svamp patogener, och de molekylära funktionerna hos de flesta effektgivare är i stort sett okända. Här beskriver vi i detalj en något modifierad version av co-infiltration analys som kan fungera som en allmän metod för att observera RNA ljuddämpning och för att karakterisera effektor proteiner utsöndras av växtpatogener. De viktigaste stegen i metoden är att välja friska och fullt utvecklade blad, justera bakteriekulturen till lämplig optisk densitet (OD) vid 600 nm, och observera grönt fluorescerande protein (GFP) fluorescens vid optimal tidpunkt på infiltrerade för att undvika att utelämna effektorer med svag dämpningsaktivitet. Detta förbättrade protokoll kommer att bidra till snabb, korrekt och omfattande screening av RNA-ljuddämpande suppressorer och fungera som en utmärkt utgångspunkt för att undersöka dessa proteiners molekylära funktioner.
Introduction
Under de senaste två decennierna har acceleration en genomsekvensering av mikroorganismer som orsakar växtsjukdomar lett till en ständigt ökande kunskapsklyfta mellan sekvensinformation och de biologiska funktionerna hos kodade proteiner1. Bland de molekyler som avslöjas av sekvensering projekt är effektor molekyler som undertrycker medfödd immunitet och underlätta värd kolonisering; dessa faktorer utsöndras av destruktiva växtpatogener, inklusive bakterier, nematoder och filamentösa mikrober. För att svara på dessa hot har värdväxter utvecklatnya receptorer som känner igen dessa effektorer, vilket möjliggör återställande av immunsvaret. Effektorer utsätts därför för olika selektiva tryck, vilket leder till diversifiering av effekt eller repertoar bland patogenhärstamningar2. Under de senaste åren har förmodade effektgivare från växtpatogener visat sig störa anläggningens medfödda immunitet genom att hindra värdcellulära processer till förmån för mikroberna på olika sätt, inklusive dysreglering av signalvägar, transkription, intracellulär transport, cytoskelettstabilitet, vesikelhandel och tystaRNA 3,4,5. De allra flesta patogeneffektfaktorer, särskilt de från glödande patogener, har dock förblivit gåtfulla.
RNA tysta är en homologi-medierad gen inaktivering maskiner som bevaras bland eukaryoter. Processen utlöses av långa dubbelsträngade RNA (dsRNA) och riktar sig till homologa enkelsträngade RNA (ssRNA) på ett sekvensspecifikt sätt, och den manipulerar ett brett spektrum av biologiska processer, inklusive antiviralt försvar6. För att övervinna medfödda immunsvar av värden, vissa virus har utvecklats för att kompensera RNA ljuddämpning, inklusive förmågan att replikera inuti intracellulära fack eller fly från ljuddämpning omorganiserade signalen. Den mest allmänna strategi genom vilken virus skyddar sina genom mot RNA-ljuddämpningsberoende förlust av genfunktion är dock att koda specifika proteiner som undertrycker RNA-ljuddämpning7,8. Flera mekanistiskt olika metoder har fastställts för att screena och karakterisera viral suppressors av RNA-ljuddämpning (VSRs), inklusive co-infiltration av Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgena växter uttrycker förmodade suppressorer, ympning och cellkultur9,10,11,12,13.
Var och en av dessa analyser har fördelar och nackdelar, och identifierar VSRs på sitt eget säregna sätt. En av de vanligaste metoderna är baserad på co-infiltration av enskilda A. tmuefaciens kulturer hysa potentiella virusprotein och en reporter gen (vanligtvis grönt fluorescerande protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c växter som utgör gfp under kontroll av blomkål mosaikvirus 35S promotorn. I avsaknad av en aktiv virusdämpande suppressor identifieras GFP som exogent av värdcellerna och tystas inom 3 dagar efter infiltration (dpi). Däremot, om virusproteinet har undertryckande aktivitet, förblir uttrycksnivån för GFP stabil bortom 3−9 dpi9. Denna co-infiltration analys är enkel och snabb; Det är dock varken mycket stabilt eller känsligt. Icke desto mindre har analysen identifierat många VSRs med olika proteinsekvenser och strukturer i många RNA-virus7,8.
Nyligen har flera effektrproteiner som kan hämma den cellulära RNA-ljuddämpningsaktiviteten karakteriserats från bakteriella, oomycete och svampväxtpatogener14,15,16. Dessa resultat innebär att RNA tysta dämpning är en gemensam strategi för att underlätta infektion som används av patogener i de flesta riken. I teorin kan många, om inte alla, av effektorerna koda RNA-ljuddämpande suppressorer (RSS). Hittills har dock endast ett fåtal identifierats, främst på grund av bristen på tillförlitlig och allmän screeningstrategi. Dessutom har suppressorer av RNA-ljuddämpning inte undersökts i de allra flesta växtpatogener17.
I denna rapport presenterar vi ett optimerat och allmänt protokoll för att identifiera växtpatogena effektorer som kan undertrycka lokala och systemiska RNA-ljuddämpning med hjälp av agro-infiltration sats. Det främsta syftet med denna studie var att betona de viktigaste aspekterna av protokollet och beskriva stegen i detalj, vilket ger en screening analys som är lämplig för nästan alla effektfaktorer av växtpatogener.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA tysta är en viktig försvarsmekanism som används av växter för att bekämpa viral, bakteriell, oomycete och svamppatogener. I sin tur har dessa mikrober utvecklats ljuddämpande suppressor proteiner för att motverka antiviral ljuddämpning, och dessa RSS stör olika steg i RNA-ljuddämpning väg22,23. Flera screening analyser har utvecklats för att identifiera RSSs10.
Här beskriver vi ett förbättrat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från “Shuguang Program” i Shanghai Education Development Foundation och Shanghai Municipal Education Commission, National Key Research and Development Program i Kina National Key R & D Program i Kina ( 2018YFD0201500), National Natural Science Foundation of China (nr 31571696 och 31660510), Thousand Talents Program för unga yrkesverksamma i Kina, och Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
