Скрининг и идентификация РНК Silencing супрессоров от секретных эффектов растительных патогенов
Summary
Здесь мы представляем модифицированный метод скрининга, который может быть широко использован для быстрого скрининга РНК глушителей в растительных патогенных микроорганизмов.
Abstract
РНК-глушитель является эволюционно сохраненным, последовательность конкретных механизмой регулировки генов в эукариотах. Несколько возбудителей растений развивались белки с возможностью ингибировать хозяина завода РНК глушитель пути. В отличие от белков вирус-эффектора, только несколько выделяемых белков-эффекторов показали способность подавлять заглушения РНК в бактериальных, омицете и грибковых патогенах, а молекулярные функции большинства эффекторов остаются в значительной степени неизвестными. Здесь мы подробно описываем слегка измененную версию соинфинигционного анализа, который может служить общим методом наблюдения заглушинием РНК и для характеристики белков-эффекторов, выделяемых растительными патогенами. Ключевыми шагами подхода являются выбор здоровых и полностью разработанных листьев, адаптация культуры бактерий к соответствующей оптической плотности (OD) на уровне 600 нм, а также наблюдение за флуоресценцией зеленого флуоресцентного белка (GFP) в оптимальное время на проникнув листья, чтобы избежать опущения эффекторов со слабой активностью подавления. Этот улучшенный протокол будет способствовать быстрому, точному и обширному скринингу супрессоров ЗАглушения РНК и служить отличной отправной точкой для исследования молекулярных функций этих белков.
Introduction
За последние два десятилетия ускорение секвенирования генома микроорганизмов, вызывающих заболевания растений, привело к постоянному увеличению разрыва в знаниях между информацией о последовательности и биологическими функциями закодированных белков1. Среди молекул, выявленных секвенированием проектов являются молекулы-эффекторы, которые подавляют врожденный иммунитет и способствуют колонизации хозяина; эти факторы выделяются разрушительными возбудителями растений, включая бактерии, нематоды и нитевидные микробы. Чтобы ответить на эти угрозы, принимающие растения развили новые рецепторы, которые распознают эти эффекторы, что позволяет восстановить иммунный ответ. Таким образом, эффекторы подвергаются различным селективным давлениям, что приводит к диверсификации репертуаров эффекторов среди патогенных линий2. В последние годы, предполагается, эффекторы из растительных патогенов было показано, нарушить растительный врожденный иммунитет, препятствуя принимающей клеточных процессов в интересах микробов в различных отношениях, в том числе дисрегуляции сигнальных путей, транскрипции, внутриклеточного транспорта, цитоскелет стабильности, везикулы торговли, и РНК улащивания3,4. Однако подавляющее большинство патогенных эффекторов, особенно от нитевидных патогенных микроорганизмов, остаются загадочными.
РНК глушитель является гомология-опосредованного гена инактивации механизма, который сохраняется среди эукариот. Этот процесс срабатывает длинной двухцепочечной РНК (dsRNA) и нацелен на гомологичную одноцепочечную РНК (ssRNA) в последовательности-специфической манере, и он манипулирует широким спектром биологических процессов, включая противовирусную защиту6. Чтобы преодолеть врожденные иммунные реакции хозяина, некоторые вирусы эволюционировали, чтобы компенсировать замалчивание РНК, в том числе способность размножаться внутри внутриклеточных отсеков или вырваться из глушителя реорганизованного сигнала. Тем не менее, наиболее общая стратегия, с помощью которой вирусы защищают свои геномы от РНК глушитель-зависимой потери генной функции является кодирование конкретных белков, которые подавляют РНК глушитель7,8. Несколько механически различных подходов были созданы для скрининга и характеристики вирусных супрессоров РНК глушитель (VSRs), в том числе совместное проникновение агробактерии tumefaciens культур, трансгенных растений, выражающих побудители, прививки и клеточной культуры9,10,11,12,13.
Каждый из этих анализов имеет преимущества и недостатки, и определяет VSRs по-своему. Один из наиболее распространенных подходов основан на совместной инфильтрации отдельных культур A. tmuefaciens укрывательство потенциального вирусного белка и репортер гена (обычно зеленый флуоресцентный белок (GFP) на Nicotiana benthamiana 16c растений, составляющих GFP под контролем мозаичного вируса цветной капусты 35S промоутер. При отсутствии активного вирусного глушителя суитоля, GFP определяется как экзогенный клетками хозяина и заглушается в течение 3 дней после инфильтрации (dpi). В отличие от этого, если вирусный белок обладает активностью подавления, уровень экспрессии GFP остается стабильным за 3’9 dpi9. Это совместное проникновение анализ прост и быстр; однако она не является ни высокой стабильной, ни чувствительной. Тем не менее, анализ выявил многочисленные VSRs с различными последовательностями и структурами белка во многих РНК-вирусах7,8.
В последнее время несколько эффектор белков, которые могут ингибировать клеточной РНК глушитель деятельности были охарактеризованы от бактериальных, oomycete, и грибковых патогенов растений14,15,16. Эти выводы подразумевают, что подавление РНК-заглушения является общей стратегией для облегчения инфекции, которая используется патогенами в большинстве королевств. Теоретически, многие, если не все, из эффекторов могут кодировать РНК глушитель супрессоров (RSSs); однако на сегодняшний день было выявлено лишь несколько из них, главным образом из-за отсутствия надежной и общей стратегии скрининга. Кроме того, супрессоры заглушения РНК не были исследованы в подавляющем большинстве возбудителей растений17.
В этом отчете мы представляем оптимизированный и общий протокол для выявления эффекторов патогенных патогенов растений, которые могут подавлять локальную и системную РНК-глушитель с помощью агроинфильтрационного асссса. Главной целью этого исследования было подчеркнуть ключевые аспекты протокола и подробно описать шаги, тем самым предоставив скрининговый анализ, который подходит почти для всех эффекторов растительных патогенов.
Protocol
Representative Results
Discussion
РНК глушитель является ключевым защитным механизмом, используемым растениями для борьбы с вирусными, бактериальными, омицетами и грибковыми патогенами. В свою очередь, эти микробы эволюционировали глушитель белков супрессора для противодействия противовирусным глушителям, и эти RSS в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от “Шугуан программы” Шанхайского фонда развития образования и Шанхайской комиссии муниципального образования, Национальной ключевой программы исследований и разработок Китайской национальной ключевой программы НИОКР Китая ( 2018YFD0201500), Национальный фонд естественных наук Китая (No 31571696 и 31660510), Программа «Тысячи талантов» для молодых специалистов Китая и Комиссия по науке и технике муниципалитета Шанхая (18D-2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
