Summary
Här presenterar vi en modifierad CLIP-seq protokoll som kallas FBIOCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rening för att fastställa RNA-mål för RNA-bindande proteiner (RBPs) i däggdjursceller.
Abstract
RNA och RNA-bindande proteiner (RBPs) kontrollerar flera biologiska processer. Den rumsliga och tidsmässiga arrangemang av RNA och RBPs ligger till grund för den känsliga regleringen av dessa processer. En strategi som kallas CLIP-seq (tvärbindning och immunoprecipitation) har utvecklats för att fånga endogena protein-RNA interaktioner med UV-tvärbindning följt av immunoprecipitation. Trots den breda användningen av konventionella CLIP-seq metod i RBP studie, clip-metoden begränsas av tillgången till högkvalitativa antikroppar, potentiella föroreningar från den copurified RBPs, krav på isotop manipulation och potentiella förlust av information under en långtråkig experimentell förfarande. Här beskriver vi en modifierad CLIP-seq metod som kallas FBIOCLIP-seq med hjälp av FLAG-biotin tag tandem rening. Genom tandemrening och stränga tvättförhållanden avlägsnas nästan alla samverkande RNA-bindande proteiner. Således minskas de RNA som interagerar indirekt av dessa copurified rbps också. Vår FBIOCLIP-seq metod möjliggör effektiv detektion av direkt protein-bundna RNAs utan SDS-PAGE och membran överföring förfaranden i en isotop-fri och protein-specifika antikroppsfritt sätt.
Introduction
RNAs och RNA-bindande proteiner (RBPs) styra olika cellulära processer inklusive splitsning, översättning, ribosomen biogenes, epigenetisk reglering, och cell öde övergång1,2,3,4,5,6. De känsliga mekanismerna i dessa processer är beroende av den unika rumsliga och tidsmässiga arrangemang av RNA och RBPs. Därför är ett viktigt steg mot att förstå RNA-reglering på molekylär nivå att avslöja positionsinformationen om rbps bindningsställen.
En strategi som benämns som tvärbindning och immunoprecipitation (CLIP-seq) har utvecklats för att fånga upp protein-RNA-interaktioner med UV-tvärbindning följt av immunoprecipitation av det protein av intresse7. Det centrala inslaget i metodiken är induktion av kovalenta tvärbindningar mellan ett RNA-bindande protein och dess direktbundna RNA-molekyler (inom ~1 Å) genom UV-bestrålning8. RBP-fotavtrycken kan bestämmas av CLIP-taggen klustring och toppanrop, som vanligtvis har en upplösning på 30−60 nt. Alternativt kan clipets omvända transkriptionssteg leda till indels (infogningar eller borttagningar) eller substitutioner till tvärbindningsställena, vilket möjliggör identifiering av proteinbindningsställen på RNA vid en enda nukleotidupplösning. Pipelines som Novoalign och CIMS har utvecklats för analys av hög genomströmning sekvensering resultaten av CLIP-seq8. Flera modifierade CLIP-seq metoder har också föreslagits, inklusive individ-nukleotid upplösning tvärbindning och immunoprecipitation (iCLIP), förstärkt CLIP (eCLIP), irCLIP, och fotoaktiv ribonucleoside-förstärkt korslänkning och immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Trots den breda användningen av traditionella CLIP-seq-metoder i studiet av RBPs har CLIP-metoderna flera nackdelar. Först, den tråkiga denaturerade gelen elektrofores och membran överföring förfarandet kan leda till förlust av information, och orsaka begränsad sekvens komplexitet. För det andra kan den proteinspecifika antikroppsbaserade CLIP-metoden dra ner ett proteinkomplex istället för ett enda målprotein, vilket kan leda till falska positiva protein-RNA-interaktioner från de copurified RBPs. För det tredje kräver den antikroppsbaserade strategin en stor mängd antikroppar av hög kvalitet, vilket gör tillämpningen av dessa metoder otillräcklig för studier av RBPs utan antikroppar av hög kvalitet tillgängliga. För det fjärde kräver den traditionella CLIP-metoden radiolabeled ATP för att märka de proteinbundna RNA.
Den höga affiniteten hos streptavidin till biotinylerade proteiner gör det till en mycket kraftfull metod för att rena specifika proteiner eller proteinkomplex. Den effektiva biotinylationen av proteiner som bär på en artificiell peptidsekvens genom ektopiskt uttryckt bakteriell BirA biotin ligase i däggdjursceller gör det till en effektiv strategi att utföra biotinrening in vivo13. Vi utvecklade en modifierad CLIP-seq metod som kallas FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-medierad Cross-linking och jagmmunoprecipitation följt av hög-genomströmning sekvensering) med hjälp av FLAG-biotin tag rening tandem14 (Figur 1). Genom tandemrening och stränga tvättförhållanden avlägsnas nästan alla samverkande RBPs (Bild 2). De stränga tvättförhållandena möjliggör också kringgå SDS-PAGE och membranöverföring, som är arbetsintensiv och tekniskt utmanande. Och liknar eCLIP och irCLIP, fbioCLIP-seq metoden är isotop-fri. Hoppa över gelen igång och överföring steg undviker förlust av information, håller autentiska protein-RNA interaktioner intakt, och ökar biblioteket komplexitet. Dessutom gör den höga effektiviteten i taggningssystemet det till ett bra val för RBPs utan högkvalitativa antikroppar tillgängliga.
Här ger vi en steg-för-steg-beskrivning av fbioCLIP-seq-protokollet för däggdjursceller. Kortfattat, celler är tvärbunden av 254 nm UV, följt av cell lys och FLAG immunoprecipitation (FLAG-IP). Därefter är protein-RNA-komplexen ytterligare renade av biotinaffinning och RNAs fragmenteras genom partiell matsmältning med MNase. Sedan är det proteinbundna RNA defosforylerat och ligerat med en 3'-länkare. En 5' RNA-linker tillsätts efter att RNA är fosforylerat med PNK och eluteras av proteinas K matsmältning. Efter omvänd transkription förstärks de proteinbundna RNA-signalerna av PCR och renas genom agarosgelrening. Två RBPs valdes för att exemplifiera fbioCLIP-seq resultatet. LIN28 är ett väl karakteriserat RNA-bindande protein som är involverat i mikroRNA-mognad, proteinöversättning, och cellomprogrammering15,16,17. WDR43 är en WD40 domän-innehållande protein tänkte att samordna ribosomen biogenes, eukaryota transkription, och embryonala stamceller pluripotency kontroll14,18. Överensstämmer med tidigare rapporterade resultat för LIN28 med CLIP-seq, fbioCLIP-seq avslöjar bindande platser av LIN28 på "GGAG" motiv i microRNA mir-let7g och mRNAs16,19 (Figur 3). WDR43 FbioCLIP-seq identifierade också bindande preferens för WDR43 med 5' externa transkriberade distanser (5'-ETS) av pre-rRNAs20 (Figur 4). Dessa resultat validerar tillförlitligheten hos metoden fbioCLIP-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celllinjekonstruktion
- Klona genen av intresse in i en PiggyBac vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA av intresse]-(Hygromycin-resistent) plasmid som bär en FLAGGA-biotin epitope13,21 att uttrycka en FLAGGA-biotin tag smält RBP (FBRBP).
- Cotransfect FBRBP uttrycker vektor med pBase vektorn i en cellinje som uttrycker BirA-enzymet22.
OBS: I denna studie, FBRBP genen var transfected till mus embryonala stamceller (mESCs) bär en integrerad BirA uttryck vektor21. Alternativt kan FBRBP uttrycksvektorn samtransmitterad till celler med pBase och pPiggyBac-BirA-V5 tillsammans. - Odla cellerna i mESC på gelatiniserade rätter och underhåll i mES odlingsmedium (Table of Materials) i 5% CO2 vid 37 °C. Markera de transfekterade cellerna med hygromycin b (100 μg/mL) i 1 vecka.
- Efter läkemedelsval, skörd celler genom SDS lastning buffert (Tabell 1) och använda en western blot23 för att bekräfta märkning och uttryck av genen med en FLAG antikropp och streptavidin-HRP, respektive.
2. Korslänkning
- Plate ~3 x 106 mES-celler i en 10 cm platta 1 dag före försöket så att cellerna kommer att växa till 70−90% sammanflödet när de skördas (~5−10 miljoner celler per prov).
- Ta bort mediet med ett vakuum. Behandla cellerna med 2 mL på 0,25 % trypsin-EDTA i 2 min vid rumstemperatur (RT) och släck trypsin med 4 mL färskt mESC-medium. Överför cellerna till ett centrifugrör på 15 mL. Snurra ner cellerna genom centrifugeringen vid 300 x g i 3 min vid 4 °C och ta bort supernatanten.
- Häng upp cellerna med 4 mL kall PBS och platta cellerna tillbaka till 10 cm plattan för tvärbindning. Tvärlänka cellerna genom strålning med 254 nm UV-ljus (ställ in UV-korslänkaren med en parameter på 400 mJ/cm2).
OBS: För cellmonolager kan cellerna korskopplas med UV-ljus direkt på plattan före trypsinbehandling. - Överför de korslänkade cellerna till ett 15 mL-rör. Snurra ner genom centrifugeringen vid 300 x g i 3 min vid 4 °C och ta bort supernatanten.
OBS: Den tvärlänkade cellpelleten kan förvaras vid -80 °C tills användning.
3. Förberedelse av cell lysate
- Lysa cellerna med 500 μL tvättbuffert A (Tabell 1) färsk kompletterad med 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 proteashämmare cocktail, och 400 U/mL RNase inhibitor. Överför cellerna till ett RNase-fritt 1,5 mL-rör. Inkubera cellerna i 30−60 min på en rotor med skonsam rotation vid 4 °C.
- Behandla lysate med 30 μL DNase I vid 37 °C i 10 min. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 4 μL på 0,5 M EDTA. Snurra ner den olösliga pelleten med 12 000 x g i 20 min vid 4 °C och överför supernatanten till ett nytt försbackat 1,5 mL-rör.
OBS: För omedelbar användning, håll på is. Om supernatanten inte kommer att användas omedelbart, förvara den vid -80 °C tills användning.
4. FLAG pärlor förberedelse
- Tillsätt 40 μL slurry FLAG pärlor per prov till en färsk 1,5 mL rör.
- Tvätta snabbt pärlorna med 0,5 mL iskall tvättbuffert A och snurra ner med 3 000 x g i 2 min vid 4 °C.
- Upprepa steg 4.2 en gång. Snurra ner pärlorna med 3 000 x g i 2 min vid 4 °C. Ta försiktigt bort bufferten med en smalsluts pipettspets. Undvik att ta bort pärlorna.
5. Immunprecipitation
- Överför cellen lysate från steg 3.2 till de pre-equilibrated FLAG pärlor. Rotera alla provexemplar på en rullskak i 4 °C försiktigt. Inkubera FLAG-pärlorna med lysate för 2−4 h eller över natten.
- Centrifugera pärlorna i 2 min vid 3 000 x g och ta bort supernatanten.
- Tvätta pärlorna med 0,5 mL förförtunnad tvättbuffert A genom inkubation i 5 min i en rotator vid 4 °C, snurra ner pärlorna med 3 000 x g i 2 min och ta bort supernatanten. Upprepa tvätten 1x.
- Upprepa tvätten 2x enligt beskrivningen i steg 5.3 med 0,5 mL förchilled tvättbuffert B (Tabell 1).
6. Eluering med 3x FLAG peptid
- Förbered 3x FLAG elueringslösning genom att lösa upp 1 mg 3x FLAG peptid med 5 mL tvättbuffert A till en slutkoncentration på 200 ng/mL.
- Snurra ner FLAG-pärlorna från steg 5.4 med 3 000 x g i 2 min. Ta bort supernatanten försiktigt. Se till att det mesta av supernatanten tas bort genom att använda en smal ändpipettspets.
- Tillsätt 200 μL 3x FLAG elueringslösning till varje prov. Inkubera proverna med skonsam rotation i 30 min vid 4 °C. Snurra ner FLAG pärlorna i 2 min vid 3.000 x g. Överför supernatanterna till färska rör.
- Upprepa elueringen 2x enligt beskrivningen i steg 6.2 och 6.3 och poola eluenterna tillsammans. Spara 5% av eluents för Western blot analys eller silver färgning för att kontrollera effektiviteten i FLAG-IP.
7. Streptavidin pärlor förberedelse
- Bered 50 μL av en streptavidin bead slurry för varje prov. Samla upp pärlorna med ett magnetiskt stativ i 30 s och ta bort supernatanten med pipettspets.
- Tvätta snabbt pärlorna med 0,5 mL iskall tvättbuffert A och samla pärlorna med ett magnetiskt stativ i 30 s.
- Upprepa tvätten 1x. Ta bort supernatanten efter tvätten.
8. Biotin affinitet rening
- Överför de sammanslagna eluenterna från steg 6.4 till streptavidinpärlorna från steg 7.3 och rotera försiktigt proverna vid 4 °C i 1−3 h eller över natten.
- Samla upp pärlorna med ett magnetiskt stativ i 30 s och ta bort supernatanten. Tvätta pärlorna 2x med 500 μL av tvättbuffert C (Tabell 1) genom skonsam rotation vid RT i 5 min.
- Samla upp pärlorna med magnetstativet och ta bort supernatanten. Tvätta pärlorna 2x med 500 μL av tvättbuffert D (Tabell 1) genom att rotera vid RT i 5 min.
- Samla upp pärlorna med magnetstativet och ta bort supernatanten. Tvätta snabbt pärlorna 2x med 500 μL av iskall PNK-buffert (Tabell 1).
9. Partiell RNA-rötning
- Gör en 105-faldig utspädning av MNase med MNase reaktionsbuffert (Tabell 1). Tillsätt 100 μL MNase-lösning till varje prov. Vortexa pärlorna vid 37 °C med en termisk mixer inställd på 1 200 varv /min (5 s körning, 30 s stopp) i 10 min, samla in pärlorna med ett magnetiskt stativ i 30 s och ta bort supernatanten.
OBS: Koncentrationen av MNase ska optimeras för olika RNA-bindande proteiner. Den MNase-koncentration som kan smälta RNAs till 30−50 nt-fragment (som bestäms av storleken på insats av det slutliga biblioteket) är optimal. - Tvätta snabbt pärlorna 2x med 500 μL av iskall PNK+EGTA-buffert (Tabell 1). Samla upp pärlorna med ett magnetiskt stativ och ta bort supernatanten mellan varje tvättsteg.
- Tvätta pärlorna 2x med 500 μL tvättbuffert C genom skonsam rotation i 5 min vid RT. Tvätta sedan snabbt pärlorna 2x med 500 μL av iskall PNK-buffert.
10. Defosforylering av RNA
- Gör en vadtarmfosfatas (CIP) reaktionsmix med 8 μL av 10x CIP-buffert (Tabell of Materials), 3 μL av CIP-enzym, och 69 μL vatten. Den totala volymen är 80 μL per reaktion.
- Samla in pärlorna med ett magnetiskt stativ och ta bort bufferten. Lägg till CIP-reaktionsmixen på pärlorna. Vortexa pärlorna vid 37 °C med en termisk mixer inställd på 1 200 varv /min (5 s körning, 30 s stopp) i 10 min.
- Tvätta snabbt pärlorna 2x med 500 μL av iskall PNK+EGTA-buffert. Tvätta snabbt pärlorna 2x med 500 μL av iskall PNK-buffert.
11. 3' linker liger
- Gör en 3' länkare mix med 4 μL av 20 μM 3' länkare, 4 μL av 10x T4 RNA ligase buffert, 4 μL av 50% PEG8000, 2 μL av T4 RNA ligase 2 (trunkerad), och 26 μL vatten. Den totala volymen är 40 μL per reaktion.
- Samla in pärlorna från steg 10.3 med ett magnetiskt stativ och ta bort bufferten. Tillsätt 40 μL av 3' linker liger mix till pärlorna. Vortexa pärlorna vid 16 °C med en termisk mixer inställd på 1 200 varv /min (5 s körning, 30 s stopp) i 3 h eller över natten.
- Tvätta snabbt pärlorna 2x med 500 μL av iskall PNK+EGTA-buffert. Tvätta snabbt pärlorna 2x med 500 μL av iskall PNK-buffert.
12. PNK-behandling
- Gör en PNK-blandning med 4 μL 10x PNK-buffert, 2 μL T4 PNK-enzym, 1 μL på 10 mM ATP och 33 μL vatten. Den totala volymen är 40 μL per reaktion.
- Samla in pärlorna med ett magnetiskt stativ och ta bort bufferten. Tillsätt 40 μL PNK mix till pärlorna. Vortexa pärlorna försiktigt vid 37 °C med en termisk mixer inställd på 1 200 rpm (5 s run, 30 s stop) i 10 min.
- Tvätta snabbt pärlorna med 500 μL iskall PNK+EGTA-buffert.
- Tvätta snabbt pärlorna med 500 μL iskall PNK-buffert. Spara 5% av pärlorna för western eller silverfärgningsanalys för att bekräfta effektiviteten av immunoprecipitation.
13. RNA-isolering
- Samla in pärlorna från steg 12.4 med ett magnetiskt stativ och ta bort bufferten. Tillsätt 200 μL proteinas K-rötningsbuffert (Tabell 1). Vortexa pärlorna i 30 min vid 37 °C med en termisk mixer inställd på 1 200 rpm (5 s run, 30 s stop). Magnetiskt isolera pärlorna och ta supernatanten för experimentet.
- Tillsätt 400 μL RNA-isoleringsreagens (Tabell över material) till supernatanten från steg 13.1, blanda noggrant, och inkubera på is i 5 min. Tillsätt 80 μL kloroform och blanda noggrant och inkubera sedan på is i 5 min. Snurra ner med 12 000 x g i 10 min 4 °C.
OBS: Detta steg ska utföras i en kemisk huva. - Ta supernatanten (~500 μL) och tillsätt två volymer isopropanol:etanolblandning (1:1), 1/10 volym på 3 M natriumacetat (pH = 5,5), och 1 μL glykogen. Frys vid -20 °C i 2 h. Centrifugera vid 4 °C med 12 000 x g i 20 min.
- Tvätta pelleten 2x med iskall 70% etanol. Snurra ner pelleten i 4 °C med 12 000 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och torka pelleten. Lös upp RNA i 5 μL RNase-fri H2O.
14. 5' RNA linker ligatur
- Gör en 5'RNA-ligeringsblandning med 1 μL av 10x T4 RNA ligasebuffert, 0,5 μL BSA (1 μg/μL), 1 μL på 10 mM ATP, 1 μL RNase-hämmare och 0,5 μL T4 RNA ligase. Den totala volymen är 4 μL per reaktion.
- Tillsätt 1 μL av 5' 20 μM RNA-länkare till RNA:rna från steg 13.4, denaturera RNA genom uppvärmning vid 70 °C i 2 min, och kyl genast på is.
- Lägg till 5' RNA-ligeringsmixen till RNA:rna från steg 14.2. Inkubera vid 16 °C över natten.
15. Omvänd transkription
- Rena RNAs enligt beskrivningen i avsnitt 13 och lös upp RNA med 11,5 μL RNasefritt vatten.
- Tillsätt 1 μL av 10 μM omvänd transkriptionsprimer till det renade RNA, värm vid 70 °C i 2 min och kyl genast på is.
- Gör en omvänd transkriptionsmix med 4 μL av 5x omvänd transkriptionsbuffert, 1 μL av 10 mM dNTPs, 1 μL av 0,1 M DTT, 1 μL RNase-hämmare och 0,5 μL omvänd transkriptas (Tabell över material). Den totala volymen är 7,5 μL per reaktion.
- Tillsätt 7,5 μL omvänd transkriptionsmix till RNA, inkubera vid 50 °C i 30 min och stoppa reaktionen genom inkubation vid 70 °C i 10 min. Låt vara vid 4 °C.
16. PCR-förstärkning
- Gör en PCR-förstärkningsmix med 15 μL av 2x PCR master mix (Table of Materials), 5 μL cDNA från steg 15,4, 0,6 μL av 10 μM framåt primer 1 ( Tabell2), 0,6 μL av 10 μM omvänd primer 1 (Tabell 2), och 8,8 μL av H2O. Den totala volymen är 30 μL.
- Förstärk cDNA med följande inställningar: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (upprepa steg 2−4 för 15−20 cykler), 72 °C 2 min, och håll vid 4 °C. Kör PCR-produkten på en 2−3% agarosgel. Skär ut DNA:t på ~100−150 bp, extrahera DNA med sats för gelutvinning (Table of Materials), och elera DNA:t med 20 μL vatten.
- Ta 3 μL av den renade PCR-produkten, förstärka med framåt primer 2 (tabell 2) och omvänd primer 2 (indexprimer; Tabell 2) enligt beskrivningen i steg 16.2 för fem cykler för att införa indexsekvenser. Rena PCR-produkten enligt beskrivningen i steg 16.2.
- Sekvens biblioteket med en hög genomströmning sekvensering plattform.
17. Bioinformatikanalys
- Utför dataanalys med hjälp av kommersiella program som tidigare beskrivits8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den schematiska representationen av proceduren fbioCLIP-seq visas i figur 1. Jämfört med FLAG-medierad eller streptavidin-medierad enstegs affinitet rening, FLAG-biotin tandem rening bort nästan alla de copurified proteiner, undvika kontaminering av indirekt protein-RNA interaktioner (Figur 2). Representativa resultat för FbioCLIP-seq för LIN28 och WDR43 avbildas i figur 3 och figur 4. Vi utförde LIN28 eller WDR43 FBIoCLIP-seq med mESCs. Bild 3A visar spårvyn av LIN28 och WDR43 FbioCLIP-seq i pre-let-7g. Det rapporterade GGAG-motivet i pre-let-7g och de tvärlänkade webbplatser som identifierats av FbioCLIP-seq visas i figur 3B. Klassificeringen av de mutationsställen som anropades av CIMS-algoritmen visade att LIN28 föredrar att binda och korslänka till G nukleotid (Figur 3C). De berikade RNA-motiven i LIN28 FBIOCLIP-seq-bindningsställen visas i figur 3D. Mer representativa spår av FbioCLIP-seq på LIN28 och HNRNPU visas i figur 3E. Jämförelse av WDR43 och LIN28 FBIOCLIP-seq visade sina olika bindningsmönster i Rn45 pre-rRNA locus (Figur 4). Figur 5 visar de representativa resultaten av FLAG och biotin tag validering efter cellinje konstruktion. Figur 6 visar representativa resultat av effektiv (Figur 6A) eller misslyckade (Figur 6B) FLAG-IP och FLAG-biotin tandem rening.
Bild 1: Schematisk representation av FBIOCLIP. UV-korslänkade celler (steg 1) är lysed i lysbuffert (steg 2). FBRBP-RNA-komplexet är immunfällt med hjälp av anti-FLAG-harts (steg 3−4). Det eluterade protein-RNA-komplexet renas ytterligare med streptavidinpärlor och stränga tvättförhållanden används för att avlägsna protein-protein interaktioner (steg 5−6). RNAs är delvis rötas av MNase och icke-protein-bundna RNA fragment tas bort genom ytterligare tvätt (steg 7−8). RNAs är sedan defosforylerade och ligerade med 3' länkare (steg 9). Då är RNA fosforylerat och eluteras av proteinas K behandling (steg 10). Renad RNAs är ligerade med en 5' RNA-linker som innehåller en 6 nt slumpmässig streckkod (steg 11). Efter omvänd transkription (steg 12) förstärks cDNA-biblioteket med PCR och sekvensering med högt genomströmning utförs (steg 13−15). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: FLAG-biotin tandemrening avlägsnar copurified proteiner. Silver färgning av FBWDR43 visade att nästan alla de interagerande proteiner som presenteras i FLAG- eller biotin-medierad enstegsrening eliminerades efter stränga tvätta i tandem rening. FLAG: FLAG-medierad affinitet rening, SA: streptavidin-medierad biotin rening, tandem: FLAG-biotin tandem rening. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Representativa resultat av LIN28 FBIOCLIP-seq. (A) Spår syn på LIN28 FBIOCLIP-seq taggar och mutation läser kallas av CIMS i pre-let-7g RNA. Taggarna som visas är unika läsningar av FbioCLIP-seq. Totalt ~ 7,7 miljoner unika läsningar för LIN28 FBIOCLIP-seq och ~ 2,2 miljoner unika läsningar för WDR43 FBIOCLIP-seq hämtades efter att ha tagit bort överflödiga läsningar. (B) Korslänkade sajter på GGAG-motivet av pre-let7-g RNA av LIN28 FbioCLIP-seq. Pilarna anger de korslänkade webbplatserna. (C) Andel muterade nukleotider i olika typer av mutationer. G är den mest frekventa tvärbunden och muterade nukleotiden. Slumpmässig: slumpmässig fördelning av de fyra nukleotider. (D) Förutsagda LIN28 bindande motiv av FBIOCLIP-seq med HOMER-algoritm. (E) Spår synpunkter på LIN28 FBIOCLIP-seq på LIN28 och HNRNPU mRNAs. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av WDR43 och LIN28 FBIOCLIP-seq på Rn45S locus. Spårvisning av WDR43 och LIN28 FBIOCLIP-seq på Rn45S locus. WDR43 och LIN28 visade olika bindningsmönster på pre-rRNA. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Representativa resultat av FLAG och biotin tag validering. FLAG eller biotin Western blot validerar märkningen av cellinjerna. Kloner #1, #2 och #4 visade effektivt uttryck och biotinylation av taggen medan #3 visade dålig uttryck för taggade proteinet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Representativa resultat av FLAG-immunoprecipitation och tandemreningseffektivitetsvalidering. (A) Exempel på effektiv rening av taggade protein genom FLAG och biotin affinitet rening. (B) Exempel på ineffektiv rening av taggat protein genom FLAG och biotin affinitet rening. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Buffert | Sammansättning |
| SDS-lastningsbuffert | 50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 0,1% bromophenolblue, 10% glycerol, 100 mM DTT |
| Tvättbuffert A | 1x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoxicholat, 0,1% SDS |
| Tvätta buffert B | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoxicholat, 0,1% SDS |
| Tvätta buffert C | 50 mM Tris pH 7,4, 2% SDS |
| Tvätta buffert D | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% SDS, 1 M urea |
| PNK-buffert | 50 mM Tris pH 7,4, 0,5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| MNase reaktionsbuffert | 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM CaCl2 |
| PNK+EGTA-buffert | 50 mM Tris pH 7,4, 0,5% NP-40, 10 mM EGTA |
| Proteinase K matsmältningsbuffert | 50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 20 μg proteinas K |
Tabell 1: Sammansättning av buffertar som används i denna studie.
| Oligo namn | Sekvens | Anteckningar | ||||
| 3' länkare | rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2 | |||||
| 5' RNA-länkare | GUUCAGAGUUCUAKAGUCCGACGUCNNNNN | |||||
| RT primer | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Framåt primer 1 | GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| Omvänd grund- och primapparat 1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Framåt primer 2 | AATGATACGGC.K | |||||
| Omvänd grund- och omstämd 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T | De röda och understrukna sekvenserna representerar Illumina-indexsekvens. | ||||
Tabell 2: Oligonukleotider som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här introducerar vi en modifierad CLIP-seq metod som kallas FBIOCLIP-seq, dra nytta av FLAG-biotin dubbelmärkning system för att utföra tandem rening av protein-RNA-komplex. Den FLAG-biotin dubbelmärkning systemet har visat sig vara kraftfull i att identifiera protein-protein och protein-DNA interaktioner13,21. Här visar vi den höga specificiteten och bekvämligheten i detta system för att identifiera RNA interagerar med proteiner. Genom tandemrening och stränga tvättförhållanden hoppade vi över det utmanande SDS-PAGE- och membranöverföringssteget, så att fler protein-RNA-interaktioner bevarades och för att undvika förorenade RNA-signaler som förmedlades av RBPs i samma komplex. Förutom, kringgå av dessa kliver undviker att märka av RNAEN med radiolabeled ATP. Detta gör proceduren mycket enklare. Observera att under utarbetandet av vår publikation, en liknande metod som kallas uvCLAP har också föreslagits24.
Flera steg är viktiga för att protokollet ska lyckas. För det första ska effektiviteten i biotinyleringen av det taggade proteinet bekräftas av Western blot före försöket (Figur 5). För det andra krävs effektiv eluering av renat protein med 3 x FLAG peptid för en framgångsrik förstärkning av RNA-signalerna. Pärlorna från steg 12.4 bör analyseras med Western blot eller silver färgning för att garantera att en anständig mängd målprotein hämtas (Figur 6). För att öka effektiviteten, antingen öka 3 x FLAG peptid koncentration i steg 6 upp till 500 ng/mL eller upprepa elution steg flera gånger för att få bättre produktion. För det tredje är det optimalt att titrera MNase-koncentrationen för varje protein vid den första prövningen. Översmältning eller otillräcklig behandling kan leda till RNA-fragment av olämpliga storlekar. Sist innehåller protokollet två omgångar affinitetsrening och mycket stränga tvätt. Endast en liten mängd renat RNAs hämtas. Reagensen ska vara RNase-fri och undvika RNA-nedbrytning efter MNase behandlingssteg.
Trots den enkla metoden finns det fortfarande vissa aspekter som kan förbättras. Till exempel kan ligering av en 5'-adapter till RNA direkt begränsa återvinningen av signalerna eftersom en betydande del av omvänd transkription kommer att avslutas av kvarvarande tvärbundna peptider. Vår aktuella studie är huvudsakligen baserad på ektopiska uttryck av taggade proteiner, vilket kan leda till vissa artefakter på grund av protein överuttryck. Det är värt att förbättra metoden genom att införa taggen i den endogena locus. CRISPR/Cas9-systemet gör celllinjekonstruktionen mycket enklare och genomförbar. Vissa studier har tillämpat eCLIP-seq-experimentet påmusvävnader 25. Härledning av knock-in möss med dubbeltaggen är också en potentiell och lovande riktning i förbättring och tillämpning av fbioCLIP-seq metoden. Vidare kan ektopiskt uttryckt bakteriell BirA ligase leda till oväntade biotinylationshändelser in vivo. Taggning av proteinet kan också påverka dess biologiska funktioner.
Ett stort antal studier har visat att cellernas genuttryck och epigenom är heterogena i stället för helt homogena, vilket tyder på att det är värdefullt att studera interaktionsnätverket på en encellsnivå. Flera strategier har utvecklats för att studera transkriptom och epigenom av enstaka celler. Inga strategier har dock rapporterats för att analysera protein-RNA interactome på en encellig nivå. Utan denaturerade gelen igång och membran överföring steg, fbioCLIP-seq kan bevara fler signaler, vilket gör det en potentiell strategi för att studera protein-RNA interaktioner på en encellig nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Bidragsstöd är från Kinas nationella grundforskningsprogram (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095) och Center for Life Sciences vid Tsinghua University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M.
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
