Принимая следующий шаг: Нейронная коаптация ортопедической модели трансплантации задних конечностей для максимального функционального восстановления в Крыса
Summary
Этот протокол представляет собой надежную, воспроизводимую модель васкуляризированного композитного аллотрансплантататата (VCA), направленную на одновременное изучение иммунологии и функционального восстановления. Время, вложенное в дотошную технику в правой задней конечности задняя ортопедическая трансплантация с сшитыми сосудистой анастомозой и нервной коапптации дает возможность изучения функционального восстановления.
Abstract
Пересадка конечностей, в частности, и васкуляризированные композитные аллотрансплантации (VCA) в целом имеют широкие терапевтические перспективы, которые были загнаны в тупик нынешних ограничений в иммуносупрессии и функционального нейромоторного восстановления. Многие модели животных были разработаны для изучения уникальных особенностей VCA, но здесь мы представляем надежную воспроизводимую модель ортопедической пересадки задних конечностей у крыс, предназначенных для одновременного исследования обоих аспектов текущего ограничения VCA: стратегии иммуносупрессии и функционального нейромоторного восстановления. В основе модели лежит приверженность тщательной, проверенной временем микрохирургических методов, таких как сшитые вручную сосудистые анастомозы и сшитые вручную нейронные коапптации бедренного нерва и седалищного нерва. Такой подход дает прочные реконструкции конечностей, которые позволяют дольше жить животных, способных реабилитации, возобновление повседневной деятельности, и функциональное тестирование. При кратковременном лечении обычных иммуносупрессивных средств, аллотрансплантированные животные выжили до 70 дней после трансплантации, и изотрансплантированные животные обеспечивают длительный контроль за 200 дней после оперативного. Доказательства неврологического функционального восстановления присутствуют через 30 дней после оперативного. Эта модель не только предоставляет полезную платформу для допроса иммунологических вопросов, уникальных для VCA и регенерации нервов, но и позволяет in vivo тестирования новых терапевтических стратегий, специально предназначенных для VCA.
Introduction
Пересадка конечностей в более широкой категории васкуляризированного композитного аллотрансплантатата (VCA) или композитного аллотрансплантатата (CTA) до сих пор не выполнила свои терапевтические перспективы. С момента первой успешной пересадки рук человека в Лионе, Франция и Луисвилле, штат Кентукки в 1998 и 1999 годах, более 100 верхних конечностей трансплантации были выполнены во всем мире в тщательно отобранных пациентов1. Более широкая применимость была загнана в тупик из-за существенного иммуносупрессии и ограниченного функционального нейромотора восстановления. Текущие стратегии иммуносупрессии приводят к 85% заболеваемости острым отторжением в лице 77% заболеваемости оппортунистической инфекцией2. С другой стороны, происходит функциональное восстановление после пересадки руки; средний инвалидность руки плеча и руки (DASH) оценки улучшить от 71 до 43, но этот уровень функции все еще может квалифицироваться как инвалидность2. Учитывая нежизне сохранение природы пересадки конечностей, современные методы должны быть уточнены в животных моделях, чтобы сделать следующий шаг в VCA.
С первой крысиной модели пересадки конечностей в 19783, многие инновационные модели животных были разработаны для продвижения области VCA4, включая сосудистые наручники анастомозы, чтобы свести к минимуму оперативное время5,6, гетеро утопические остеомиоккутанные трансплантации, чтобы свести к минимуму физиологическое оскорбление реципиента животных7,8,9,10,11, и новые иммунологические подходы7,12,13,14. Крыса модель ортотопных правой задней конечности середине бедра трансплантации представлены здесь подчеркивает тщательно, проверенные временем микрохирургические методы, такие как руки сшиты сосудистые анастомозы и нервной коапптации в качестве авансового инвестирования в надежной, воспроизводимой модели платформы одновременно исследовать оба аспекта текущего ограничения VCA: стратегии иммунодепрессиции и функционального нейромоторного восстановления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Трансплантация конечностей, под более широкой категорией сосудистого компонента аллотрансплантации (VCA), широко применяется терапевтические перспективы до сих пор невыполненными. Основные препятствия лежат в нерешенных иммунологических вопросов, уникальных для VCA и нейромоторных ме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Фондом Франкеля и Северо-Западной мемориальной больницей Маккормик Грант (Операция RESTORE). Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером T32GM008152. Эта работа была поддержана Северо-Западного университета микрохирургии ядро и поведенческие фенотипирования ядра.
Materials
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
- Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
- Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
- Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
- Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
- Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
- Greene, E. C. . Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , 27 (1935).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
- Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
- Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
- Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
- Georgiade, N. G., Serafin, D. . A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
- Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
- Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
- Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
- Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
- Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
- Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).
