Het nemen van de volgende stap: een neurale coaptatie orthotopische achterste ledemaat transplantatie model om functioneel herstel in Rat maximaliseren
Summary
Dit protocol presenteert een robuust, reproduceerbaar model van vascularized composiet allotransplant (VCA) gericht op gelijktijdige studie van immunologie en functioneel herstel. De tijd geïnvesteerd in zorgvuldige techniek in een rechter mid-dij achterpoot orthotopische transplantatie met de hand genaaid vasculaire anastomoses en neurale coaptatie levert de mogelijkheid om functioneel herstel te bestuderen.
Abstract
Limb in het bijzonder en gevasculariseerde composiet allotransplant (VCA) in het algemeen hebben brede therapeutische belofte die zijn gedwarsboomd door de huidige beperkingen in immunosuppressie en functioneel neuromotorisch herstel. Veel diermodellen zijn ontwikkeld voor het bestuderen van unieke kenmerken van VCA, maar hier presenteren we een robuust reproduceerbaar model van orthotopische achterpoottransplantatie bij ratten die zijn ontworpen om tegelijkertijd beide aspecten van de huidige VCA-beperking te onderzoeken: immunosuppressiestrategieën en functioneel neuromotorisch herstel. In de kern van het model rust een inzet voor nauwgezette, beproefde microchirurgische technieken zoals met de hand genaaid vasculaire anastomoses en de hand genaaid neurale coaptatie van de femorale zenuw en de heupzenuw. Deze aanpak levert duurzame ledemaat reconstructies die het mogelijk maken voor langer levende dieren in staat van revalidatie, hervatting van de dagelijkse activiteiten, en functionele testen. Met de behandeling op korte termijn van conventionele immunosuppressieve middelen overleefden allotransplanted dieren tot 70 dagen na de transplantatie, en isotransplanted dieren bieden langdurige controles na 200 dagen na de operatie. Bewijs van neurologisch functioneel herstel is aanwezig met 30 dagen post operatief. Dit model biedt niet alleen een nuttig platform voor het ondervragen van immunologische vragen die uniek zijn voor VCA en zenuwregeneratie, maar maakt het ook mogelijk om in vivo nieuwe therapeutische strategieën te testen die specifiek zijn afgestemd op VCA.
Introduction
Ledemaattransplantatie onder de bredere categorie van vascularized-composiet allotransplant (VCA) of composiet weefsel allotransplant (CTA) heeft nog niet voldoen aan haar therapeutische belofte. Sinds de eerste succesvolle menselijke handtransplantaties in Lyon, Frankrijk en Louisville, Kentucky in 1998 en 1999, zijn meer dan 100 bovenste extremiteitstransplantaties wereldwijd uitgevoerd bij zorgvuldig geselecteerde patiënten1. Bredere toepasbaarheid is gestwarsboomd door aanzienlijke immunosuppressie en beperkt functioneel neuromotorisch herstel. De huidige immunosuppressiestrategieën resulteren in 85% incidentie van acute afstoting in het gezicht van 77% incidentie van opportunistische infectie2. Aan de andere kant vindt functioneel herstel na handtransplantatie plaats; gemiddelde Handicap van Arm Schouder en Hand (DASH) scores verbeteren van 71 tot 43, maar dat niveau van de functie kan nog steeds in aanmerking komen als een handicap2. Gezien de niet-levensreddende aard van ledemaattransplantatie, moeten de huidige technieken worden verfijnd in diermodellen om de volgende stap in VCA te zetten.
Sinds het eerste rattenmodel van ledemaattransplantatie in 19783zijn veel innovatieve diermodellen ontwikkeld om het veld van VCA4te bevorderen, met vasculaire geboeide anastomoses om de operatieve tijd5,6,heterotopische osteo te minimaliserenmyocutane transplantaties om fysiologische beledigingen aan het ontvangende dier te minimaliseren7,8,9,10,11, en nieuwe immunologische benaderingen7,12,13,14. Het hier gepresenteerde rattenmodel van orthotopische rechter achterpoot transplantatie benadrukt nauwgezette, beproefde microchirurgische technieken zoals met de hand genaaide vasculaire anastozos en neurale coaptatie als een investering vooraf in een robuust, reproduceerbaar modelplatform om tegelijkertijd beide aspecten van de huidige VCA te onderzoeken: immunosuppressiestrategieën en functioneel neuromotorisch herstel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Limb transplantatie, onder de bredere categorie van gevasculariseerde component allotransplantation (VCA), heeft op grote schaal toepasbare therapeutische belofte nog onvervuld. De belangrijkste wegversperringen liggen in onopgeloste immunologische problemen die uniek zijn voor VCA en neuromotorische hersteltechnieken die momenteel worden gebruikt. De ontwikkeling van nieuwe technieken zal afhangen van dierlijke modellering die flexibel, robuust en reproduceerbaar is.
Veel diermodellen zijn ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Frankel Foundation en het Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operatie RESTORE). Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of General Medicial Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number T32GM008152. Dit werk werd ondersteund door de Northwestern University Microsurgery Core en Behavioral Phenotyping Core.
Materials
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
- Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
- Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
- Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
- Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
- Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
- Greene, E. C. . Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , 27 (1935).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
- Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
- Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
- Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
- Georgiade, N. G., Serafin, D. . A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
- Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
- Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
- Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
- Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
- Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
- Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).
