LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per montare larve di Drosophila per ottenere più di 10 h di immagini ininterrotte intime in animali vivi intatti. Questo metodo può essere utilizzato per immaginare molti processi biologici vicino alla parete del corpo larvale.
Abstract
L’imaging dal vivo è un approccio prezioso per studiare le domande sulla biologia cellulare. La larva della Drosophila è particolarmente adatta per l’imaging vivo in vivo perché la parete larvale del corpo e la maggior parte degli organi interni sono trasparenti. Tuttavia, l’imaging live continuo di larve di Drosophila intatte per più di 30 min è stato impegnativo perché è difficile immobilizzare le larve per lungo tempo. Qui presentiamo un metodo di montaggio larvale chiamato LarvaSPA che consente l’imaging continuo di larve di Drosophila vive con alta risoluzione temporale e spaziale per più di 10 ore. Questo metodo prevede l’attaccamento parziale delle larve al coperchio utilizzando una colla UV-reattiva e inoltre un movimento larvale che trattiene utilizzando un blocco polidimetilsiloxane (PDMS). Questo metodo è compatibile con le larve in fase di sviluppo dal secondo instar al terzo instar errante. Dimostriamo l’applicazione di questo metodo nello studio dei processi dinamici dei neuroni somatosensoriali della Drosophila, tra cui la crescita dei dendrite e la degenerazione dei dendriti indotta da lesioni. Questo metodo può essere applicato anche per studiare molti altri processi cellulari che avvengono vicino alla parete del corpo larvale.
Introduction
L’imaging live time-lapse è un metodo potente per studiare i processi cellulari dinamici. Le informazioni spaziali e temporali fornite dai filmati time-lapse possono rivelare dettagli importanti per rispondere alle domande della biologia cellulare. La larva della Drosophila è stata un modello in vivo diffuso per le indagini utilizzando l’imaging dal vivo perché la sua parete del corpo trasparente consente l’imaging non invasivo delle strutture interne1,2. Inoltre, in Drosophila sono disponibili numerosi strumenti genetici per etichettare fluorescentmente strutture anatomiche e macromolecole3. Tuttavia, l’imaging a lungo termine delle larve della Drosophila è impegnativo. A differenza degli embrioni precoci stazionari o delle pupe, le larve di Drosophila si muovono costantemente, rendendo necessaria l’immobilizzazione per l’imaging dal vivo. Modi efficaci di immobilizzare le larve di Drosophila vive includono il montaggio in olio di alocarbonio con cloroformio4, anestesizzando utilizzando la soluzione isoflurane o Dichlorvos5, e la compressione tra il coperchio e il microscopio6. Anche se alcuni di questi metodi sono stati utilizzati per la microscopia, nessuno di essi è efficace per l’imaging dal vivo a lungo termine. Altri metodi sono stati sviluppati per l’imaging di neuroni della parete del corpo nelle larve striscianti utilizzando la microscopia confocale convenzionale o la microscopia a fogli di luce7,8,9. Tuttavia, questi metodi non sono ideali per monitorare la dinamica cellulare a causa del movimento delle larve.
Sono stati sviluppati nuovi metodi per ottenere l’imaging a lungo termine delle larve della Drosophila. Utilizzando un “chip larva” polidimetilsiloxane (PDMS), le larve di Drosophila possono essere efficacemente immobilizzate attraverso un’aspirazione generata dal vuoto in una microcamera specializzata senza anestesizzazione. Tuttavia, questo metodo non offre alta risoluzione temporale per gli studi di biologia cellulare e ha severe limitazioni sulla dimensione animale10. Un altro metodo che utilizza un dispositivo di anestesizzazione ha raggiunto l’imaging dal vivo delle larve di Drosophila in più punti temporali ed è stato applicato per studiare giunzioni neuromuscolari11,12,13,14,15,16. Tuttavia, questo metodo inoltre non consente l’imaging continuo per più di 30 min e richiede l’uso di desflurane ripetutamente, che può inibire l’attività neurale e influenzare il processo biologico studiato17,18. Recentemente, un nuovo metodo che combina dispositivo microfluidico e crioanestesia è stato utilizzato per immobilizzare larve di varie dimensioni per brevi periodi di tempo (minuti)19. Tuttavia, questo metodo richiede dispositivi specializzati come un sistema di raffreddamento e lunghi periodi di immobilizzazione richiedono il raffreddamento ripetuto delle larve.
Qui presentiamo un metodo versatile per immobilizzare le larve di Drosophila che è compatibile con l’imaging time-lapse ininterrotto per più di 10 h. Questo metodo, che chiamiamo “Stabilizzazione larva per attaccamento parziale” (LarvaSPA), prevede l’adesione della cuticola larvale a un coperchio per l’imaging in una camera di imaging costruita su misura. Questo protocollo descrive come fare la camera di imaging e come montare le larve in una varietà di stadi di sviluppo. Nel metodo LarvaSPA, i segmenti del corpo desiderati vengono apposti sul coperchio utilizzando una colla UV-reattiva. Un cuboide PDMS applica inoltre pressione alle larve, impedendo la fuga. L’aria e l’umidità nella camera di imaging assicurano la sopravvivenza delle larve parzialmente immobilizzate durante l’imaging. I vantaggi di LarvaSPA rispetto ad altre tecniche includono quanto segue: (1) È il primo metodo che consente l’imaging dal vivo continuo di larve di Drosophila intatte per ore ad alta risoluzione temporale e spaziale; (2) Il metodo ha meno limitazioni sulle dimensioni della larva; (3) La camera di imaging e i cuboidi PDMS possono essere fabbricati ad un costo minimo e sono riutilizzabili.
Oltre a descrivere il metodo di montaggio larvale, forniamo diversi esempi della sua applicazione per studiare lo sviluppo dei dendriti e la degenerazione dei dendrite dei neuroni dell’arborizzazione dendritica (da) della Drosophila.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo LarvaSPA, un metodo versatile per montare larve di Drosophila vive per l’imaging time-lapse a lungo termine. Questo metodo non richiede il recupero o il rimontaggio delle larve, consentendo l’imaging ininterrotto. È quindi ideale per tracciare i processi biologici che richiedono ore per essere completati, come la degenerazione e la rigenerazione dei dendriti. Questo metodo può essere utilizzato anche per l’imaging di dinamiche intracellulari del calcio ed eventi subcellulari come la crescita di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Lingfeng Tang per aver stabilito una versione precedente del metodo LarvaSPA; Glenn Swan al negozio Cornell Olin Hall Machine per fare prototipi precedenti della camera di imaging; Philipp Isermann per la costruzione di telai metallici e fornire suggerimenti sulla realizzazione di cuboidi PDMS; Struttura Cornell BRC Imaging per l’accesso ai microscopi (finanziata dalla sovvenzione NIH S10OD018516); Maria Sapar per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una Cornell Fellowship assegnata a H.J.; un fondo di start-up Cornell e sovvenzioni NIH (R01NS099125 e R21OD023824) assegnato a C.H. H.J. e C.H. hanno concepito il progetto e progettato gli esperimenti. H.J. condusse gli esperimenti. H.J e C.H. hanno scritto il manoscritto.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
Referências
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
