LarvaSPA, 장기 시간 경과 이미징을 위한 초파리 유충을 장착하는 방법
Summary
이 프로토콜은 그대로 살아있는 동물에서 중단없는 시간 경과 이미징의 10 시간 이상을 달성하기 위해 Drosophila 애벌레를 장착하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 애벌레 몸벽에 가까운 많은 생물학적 과정을 이미지화하는데 사용될 수 있다.
Abstract
살아있는 화상 진찰은 세포 생물학 질문을 조사하기 를 위한 귀중한 접근입니다. Drosophila 애벌레는 애벌레 바디 벽 및 대부분의 내부 기관이 투명하기 때문에 생체 내 살아있는 화상 진찰을 위해 특히 적당합니다. 그러나, 30분 이상 온전한 초파리 유충의 지속적인 실시간 영상촬영은 오랜 시간 동안 비침습적으로 고정화하기 어렵기 때문에 도전적이다. 여기에서 우리는 10 시간 이상 높은 시간 및 공간 해결책을 가진 살아있는 Drosophila 애벌레의 연속적인 화상 진찰을 허용하는 LarvaSPA에게 불린 애벌레 장착 방법을 제시합니다. 이 방법은 UV 반응성 접착제를 사용하여 커버 슬립에 유충을 부분적으로 부착하고 폴리디메틸실록산 (PDMS) 블록을 사용하여 애벌레 의 움직임을 추가로 억제하는 것을 포함합니다. 이 방법은 두 번째 instar에서 방황 세 번째 instar에 개발 단계에서 애벌레와 호환됩니다. 우리는 수상 돌기 성장 및 부상 유발 모수석 변성을 포함하여 Drosophila 체감각 뉴런의 동적 과정을 연구하는이 방법의 응용 프로그램을 보여줍니다. 이 방법은 또한 애벌레 바디 벽 의 가까이에 일어나는 많은 그밖 세포 프로세스를 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다.
Introduction
타임랩스 라이브 이미징은 동적 세포 과정을 연구하는 강력한 방법입니다. 타임랩스 영화에서 제공하는 공간적 및 시간적 정보는 세포 생물학 질문에 답하기 위한 중요한 세부 사항을 나타낼 수 있습니다. Drosophila 애벌레는 그것의 투명한 바디 벽이 내부 구조물의 비침범성 화상 진찰을 허용하기 때문에 살아있는 화상 진찰을 사용하여 조사를 위한 대중적인 생체 내모형이었습니다 1,2. 또한, 수많은 유전 도구는 형광 적으로 해부학 구조 및 거대 분자 를 라벨 에 Drosophila에서 사용할 수 있습니다3. 그러나, 초파리 유충의 장기 시간 경과 화상 진찰은 도전적입니다. 고정된 초기 태아 또는 pupae와는 달리, Drosophila 애벌레는 살아있는 화상 진찰을 위한 고정화를 필요로 하는 끊임없이 움직입니다. 살아있는 Drosophila 유충을 고정시키는 효과적인 방법은 클로로포름4를가진 할로카본 오일에 장착, 이소플루란 또는 디클로르보스 용액5를사용하여 마취하고, 커버슬립과 현미경슬라이드(6)사이를 압축하는 것을 포함한다. 이 방법 중 일부는 현미경 검사법을 위해 이용되었더라도, 그(것)들의 아무도는 장기 살아있는 화상 진찰을 위해 효과적이지 않습니다. 다른 방법은 기존의 공초점 현미경 또는 광시트 현미경7,8,9를사용하여 유충을 크롤링하는 체내 벽 뉴런을 이미징하기 위해 개발되었다. 그러나, 이러한 방법은 애벌레의 움직임으로 인해 세포 역학을 모니터링하는 데 이상적이지 않습니다.
새로운 방법은 초파리 애벌레의 장기 시간 경과 영상을 달성하기 위해 개발되었다. 다디디메틸실록산(PDMS) “유충 칩”을 사용하여, 드로소필라 유충은 마취 없이 특수 마이크로챔버에서 진공 생성 흡입을 통해 효과적으로 고정화될 수 있다. 그러나,이 방법은 세포 생물학 연구에 대한 높은 시간적 해상도를 제공하지 않으며 동물 크기10에엄격한 제한이 있습니다. 마취 장치를 이용한 또 다른 방법은 여러 시점에서 초파리 유충의 실시간 이미징을 달성하고 신경근접합부 11,12,13,14,15,16을연구하기 위해 적용되었다. 그러나, 이 방법은 또한 30분 이상 연속적인 이미징을 허용하지 않으며,17,18을연구한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있는 데스플루란을 반복적으로 사용해야 한다. 최근에는 미세유체 장치와 극저온 마취를 결합하는 새로운 방법이 단기간(분)19시간동안 다양한 크기의 유충을 고정시키는 데 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 냉각 시스템과 같은 특수 장치를 필요로하고 고정화의 긴 기간은 유충의 반복 냉각을 필요로한다.
여기에서 우리는 10 시간 이상 동안 중단 없는 시간 경과 화상 진찰과 호환되는 Drosophila 애벌레를 고정시키는 다재다능한 방법을 제시합니다. 우리가 “부분 부착에 의한 애벌레 안정화”(LarvaSPA)라고 부르는이 방법은 맞춤형 이미징 챔버에서 이미징을위한 커버 슬립에 애벌레 표피를 부착하는 것을 포함합니다. 이 프로토콜은 이미징 챔버를 만드는 방법과 다양한 발달 단계에서 애벌레를 장착하는 방법을 설명합니다. LarvaSPA 방법에서, 원하는 바디 세그먼트는 UV 반응성 접착제를 사용하여 커버슬립에 부착된다. PDMS 입방체는 또한 유충에 압력을 가하여 탈출을 방지합니다. 이미징 챔버의 공기와 습기는 이미징 중에 부분적으로 고정된 유충의 생존을 보장합니다. 다른 기술에 비해 LarvaSPA의 장점은 다음과 같습니다 : (1) 높은 시간 및 공간 해상도와 시간 동안 그대로 Drosophila 유충의 지속적인 라이브 이미징을 허용하는 첫 번째 방법입니다; (2) 방법은 애벌레 크기에 적은 제한이; (3) 이미징 챔버 와 PDMS 입방체는 최소한의 비용으로 제조 할 수 있으며 재사용할 수 있습니다.
애벌레 장착 방법을 설명하는 것 외에도, 우리는 초파리 수지상 arborization (da) 뉴런의 모수석 개발 및 모수석 변성을 연구하기위한 응용 프로그램의 몇 가지 예를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 LarvaSPA, 장기 시간 경과 화상 진찰을 위한 살아있는 초파리 애벌레를 설치의 다재다능한 방법을 기술합니다. 이 방법은 유충을 복구하거나 재장착할 필요가 없기 때문에 중단 없는 이미징이 가능합니다. 따라서 모수석 변성 및 재생과 같이 완료하는 데 몇 시간이 걸리는 생물학적 과정을 추적하는 데 이상적입니다. 이 방법은 또한 화상 진찰 세포 내 칼슘 역학 및 microtubule ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 LarvaSPA 방법의 이전 버전을 설정 링펑 탕 감사합니다; 이미징 챔버의 초기 프로토 타입을 만들기위한 코넬 올린 홀 기계 가게에서 글렌 스완; 금속 프레임을 구성하고 PDMS 입방체 를 만들기에 대한 제안을 제공하기위한 필립 Isermann; 현미경에 접근을 위한 코넬 BRC 화상 진찰 시설 (NIH 교부금 S10OD018516에 의해 투자됨); 원고의 비판적 독서에 대한 마리아 사파르. 이 작품은 H.J.에게 수여 된 코넬 펠로우십에 의해 지원되었다; 코넬 스타트업 펀드와 NIH 보조금(R01NS099125 및 R21OD023824)은 C.H.H.J. 및 C.H.에게 수여되어 프로젝트를 구상하고 실험을 설계했습니다. H.J.는 실험을 수행하였다. H.J와 C.H.는 원고를 썼습니다.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
Referências
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