LarvaSPA，一种用于长期延时成像的安装果蝇幼虫的方法
Summary
该协议描述了一种在完整的活体动物中安装果蝇幼虫以实现超过10小时的不间断延时成像的方法。该方法可用于成像许多靠近幼虫体壁的生物过程。
Abstract
活成像是研究细胞生物学问题的宝贵方法。果蝇幼虫特别适合体内活体成像，因为幼虫体壁和大多数内部器官是透明的。然而，对完整果蝇幼虫进行超过30分钟的连续活成像一直具有挑战性，因为长期以来很难非侵入性的防活动幼虫。在这里，我们提出了一种称为LarvaSPA的幼虫安装方法，它允许对具有高时空分辨率的活果蝇幼虫进行连续成像，时间及空间分辨率超过10小时。此方法涉及使用紫外线反应胶将幼虫部分附着在盖玻片上，并使用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 块额外限制幼虫运动。该方法与处于发育阶段的幼虫相容，从第二星到游荡第三星。我们演示了这种方法在研究果蝇体细胞感觉神经元的动态过程中的应用，包括树突生长和损伤引起的树突退化。该方法还可用于研究在幼虫体壁附近发生的许多其他细胞过程。
Introduction
延时实时成像是研究动态细胞过程的有力方法。延时电影提供的空间和时间信息可以揭示回答细胞生物学问题的重要细节。果蝇幼虫一直是一个流行的体内模型，用于使用活成像研究，因为它透明的体壁允许对内部结构1，2进行非侵入性成像。此外，在果蝇中，有许多遗传工具可用于荧光标记解剖结构和大分子3。然而，对果蝇幼虫进行长期延时成像具有挑战性。与静止的早期胚胎或幼虫不同，果蝇幼虫不断移动，需要固定进行活体成像。固定活果蝇幼虫的有效方法包括：用氯仿4安装在卤化碳油中，使用胶原素或二氯沃斯溶液5进行麻醉，以及压缩盖玻片和显微镜幻灯片6。虽然其中一些方法已用于显微镜，但没有一个对长期活成像有效。其他方法被开发成像身体壁神经元在爬行幼虫使用传统的共聚焦显微镜或光片显微镜7，8，9。然而，由于幼虫的运动，这些方法不是监测细胞动力学的理想方法。
开发了新的方法，以实现果蝇幼虫的长期延时成像。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）”幼虫芯片”，果蝇幼虫可以通过真空产生的吸力在专用微室中有效固定，无需麻醉。然而，这种方法没有为细胞生物学研究提供高时间分辨率，对动物大小10有严格的限制。另一种使用麻醉装置的方法在多个时间点实现了果蝇幼虫的活成像，并已应用于研究神经肌肉结11、12、13、14、15、16。然而，这种方法也不允许连续成像超过30分钟，并要求反复使用去氟化物，这可以抑制神经活动，影响研究17，18的生物过程。最近，一种将微流体装置和冷冻麻醉相结合的新方法被用于短时间（分钟）19固定各种大小的幼虫。然而，这种方法需要专门的设备，如冷却系统，长时间的固定需要反复冷却幼虫。
在这里，我们提出了一种多功能的固定果蝇幼虫的方法，与不间断的延时成像相容，时间超过10小时。这种方法，我们称之为”拉瓦稳定部分附件”（LarvaSPA），涉及将幼虫角膜粘附在一个覆盖玻片上，用于在定制的成像室进行成像。该协议描述了如何使成像室，以及如何在各种发育阶段安装幼虫。在 LarvaSPA 方法中，所需的车身段使用紫外线反应胶贴在盖玻片上。PDMS 立体体另外对幼虫施加压力，防止逃生。成像室中的空气和水分可确保在成像过程中部分固定的幼虫存活。LarvaSPA 比其他技术的优点包括：（1） 它是允许对完整的果蝇幼虫进行连续活成像的第一种方法，其时间和空间分辨率较高;（2）该方法对幼虫大小的限制较少;（3） 成像室和PDMS立体体可以以最低的成本制造，并且可重复使用。
除了描述幼虫安装方法外，我们还提供了几个用于研究树突发育和树突变性的树突树种树突化（da）神经元的例子。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了LarvaSPA，一种用于长期延时成像的多功能安装活果蝇幼虫的方法。此方法不需要恢复或重新安装幼虫，可实现不间断的成像。因此，它是跟踪需要数小时才能完成的生物过程的理想选择，例如树突退化和再生。该方法还可用于成像细胞内钙动力学和亚细胞事件，如微管生长。由于幼虫体壁在成像过程中是稳定的，因此可以调整空间和时间分辨率以适应手头的成像应用（?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢唐灵峰建立了早期版本的拉瓦SPA方法;格伦·斯旺在康奈尔奥林霍尔机器商店制造早期原型的成像室;菲利普·伊瑟曼用于构建金属框架，并提供PDMS立体体制作建议;康奈尔BRC成像设备用于显微镜（由NIH赠款S10OD018516资助）;玛丽亚·萨帕尔对手稿进行批判性阅读。这项工作得到了康奈尔大学奖学金授予H.J.的支持;康奈尔大学启动基金和NIH赠款（R01NS099125和R21OD023824）授予C.H.H.J.和C.H.构思该项目并设计了实验。H.J.进行了实验。H.J.和C.H.写了手稿。
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
Referências
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