LarvaSPA, en metode for montering drosophila larve for langsiktig time-lapse imaging
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for montering av Drosophila larver for å oppnå mer enn 10 timer uavbrutt time-lapse imaging hos intakte levende dyr. Denne metoden kan brukes til å bilde mange biologiske prosesser nær larval kroppen veggen.
Abstract
Live imaging er en verdifull tilnærming for å undersøke cellebiologi spørsmål. Drosophila larve er spesielt egnet for in vivo levende bildebehandling fordi larval kroppen veggen og de fleste indre organer er gjennomsiktig. Imidlertid har kontinuerlig levende avbildning av intakte Drosophila larver i mer enn 30 min vært utfordrende fordi det er vanskelig å ikke-invasivt immobilisere larver i lang tid. Her presenterer vi en larvemonteringsmetode kalt LarvaSPA som muliggjør kontinuerlig avbildning av levende Drosophila larver med høy temporal og romlig oppløsning i mer enn 10 timer. Denne metoden innebærer delvis å feste larver til dekkslip ved hjelp av et UV-reaktivt lim og i tillegg begrense larval bevegelse ved hjelp av en polydimethylsiloxane (PDMS) blokk. Denne metoden er kompatibel med larver på utviklingsstadier fra andre instar til vandrende tredje instar. Vi viser anvendelser av denne metoden for å studere dynamiske prosesser av Drosophila somatosensoriske nevroner, inkludert dendrittvekst og skadeindusert dendrittdegenerasjon. Denne metoden kan også brukes til å studere mange andre cellulære prosesser som skjer nær larval kroppsveggen.
Introduction
Time-lapse live imaging er en kraftig metode for å studere dynamiske cellulære prosesser. Den romlige og timelige informasjonen fra time-lapse-filmer kan avsløre viktige detaljer for å svare på cellebiologispørsmål. Drosophila larve har vært en populær in vivo modell for undersøkelser ved hjelp av live imaging fordi den gjennomsiktige kroppsveggen tillater ikke-invasiv avbildning av interne strukturer1,2. I tillegg er mange genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila for å fluorescerende merke anatomiske strukturer og makromolekyler3. Langvarig tidsforløpsavbildning av Drosophila larver er imidlertid utfordrende. I motsetning til stasjonære tidlige embryoer eller pupper beveger Drosophila larver seg hele tiden, noe som nødvendiggjør immobilisering for levende bildebehandling. Effektive måter å immobilisere levende Drosophila larver inkluderer montering i halokarbonolje med kloroform4, beholdende ved hjelp av isofluran eeller Dichlorvos løsning5,og komprimere mellom dekkslip og mikroskoplysbilde6 . Selv om noen av disse metodene har blitt brukt til mikroskopi, er ingen av dem effektive for langsiktig live imaging. Andre metoder ble utviklet for bildeveggnevroner i krypende larver ved hjelp av konvensjonell konfokal mikroskopi eller lysarkmikroskopi7,8,9. Disse metodene er imidlertid ikke ideelle for overvåking av cellulær dynamikk på grunn av larverbevegelsen.
Nye metoder er utviklet for å oppnå langsiktig time-lapse avbildning av Drosophila larver. Ved hjelp av en polydimethylsiloxane (PDMS) “larvechip”, kan Drosophila larver effektivt immobiliseres gjennom vakuumgenerert suging i et spesialisert mikrokammer uten betisering. Denne metoden gir imidlertid ikke høy timelig oppløsning for cellebiologistudier, og den har strenge begrensninger på dyrstørrelse10. En annen metode ved hjelp av en anestesilege oppnådde levende avbildning av Drosophila larver på flere tidspunkter og har blitt brukt til å studere nevromuskulære veikryss11,12,13,14,15,16. Denne metoden tillater imidlertid heller ikke kontinuerlig bildebehandling i mer enn 30 min og krever bruk av desfluran gjentatte ganger, noe som kan hemme nevrale aktivitet og påvirke den biologiske prosessen som studeres17,18. Nylig har en ny metode som kombinerer mikrofluidisk enhet og kryoanesthesi blitt brukt til å immobilisere larver av forskjellige størrelser i korte perioder (minutter)19. Denne metoden krever imidlertid spesialiserte enheter som et kjølesystem og lengre perioder med immobilisering krever gjentatt kjøling av larver.
Her presenterer vi en allsidig metode for å immobilisere Drosophila larver som er kompatible med uavbrutt time-lapse imaging i mer enn 10 timer. Denne metoden, som vi kaller “Larva Stabilisering av Delvis Vedlegg” (LarvaSPA), innebærer å følge larval cuticle til en coverslip for bildebehandling i et spesialbygd bildekammer. Denne protokollen beskriver hvordan man lager bildekammeret og hvordan man monterer larver på en rekke utviklingsstadier. I LarvaSPA-metoden festes de ønskede kroppssegmentene til dekksslip ved hjelp av et UV-reaktivt lim. En PDMS cuboid i tillegg legger press på larver, hindrer flukt. Luften og fuktigheten i bildekammeret sikrer overlevelsen av de delvis immobiliserte larver under bildebehandling. Fordeler med LarvaSPA over andre teknikker inkluderer følgende: (1) Det er den første metoden som tillater kontinuerlig levende avbildning av intakte Drosophila larver i timevis med høy temporal og romlig oppløsning; (2) Metoden har færre begrensninger på larval størrelse; (3) Bildekammeret og PDMS cuboids kan produseres til en minimal kostnad og kan brukes på nytt.
I tillegg til å beskrive larval monteringsmetoden, gir vi flere eksempler på sin søknad om å studere dendrittutvikling og dendrittdegenerasjon av Drosophila dendritic arborization (da) nevroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi LarvaSPA, en allsidig metode for montering live Drosophila larver for langsiktig time-lapse imaging. Denne metoden krever ikke utvinne eller remontering larver, slik at uavbrutt bildebehandling. Det er derfor ideelt for å spore biologiske prosesser som tar timer å fullføre, for eksempel dendrittdegenerasjon og regenerering. Denne metoden kan også brukes til bildebehandling intracellulær kalsiumdynamikk og subcellulære hendelser som mikrotubulvekst. Siden larvalensvegg er stabil under avbil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Lingfeng Tang for å etablere en tidligere versjon av LarvaSPA-metoden; Glenn Swan på Cornell Olin Hall Machine butikk for å lage tidligere prototyper av bildekammeret; Philipp Isermann for å konstruere metallrammer og gi forslag til å lage PDMS cuboids; Cornell BRC Imaging-anlegg for tilgang til mikroskoper (finansiert av NIH grant S10OD018516); Maria Sapar for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et Cornell Fellowship tildelt H.J.; et Cornell oppstartsfond og NIH-tilskudd (R01NS099125 og R21OD023824) tildelt C.H. H.J. og C.H. unnfanget prosjektet og designet eksperimentene. H.J. gjennomførte eksperimentene. H.J og C.H. skrev manuskriptet.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
Referências
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
