Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Summary

Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l’imaging multispettrale sui tessuti congelati.

Abstract

L’imaging a fluorescenza multispettrale su tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) consente di rilevare più marcatori in un singolo campione di tessuto in grado di fornire informazioni sulla coespressione dell’antigene e sulla distribuzione spaziale dei marcatori. Tuttavia, la mancanza di anticorpi adatti per i tessuti fissati in formalina può limitare la natura dei marcatori che possono essere rilevati. Inoltre, il metodo di colorazione richiede molto tempo. Qui descriviamo un metodo rapido per eseguire l’imaging a fluorescenza multispettrale sui tessuti congelati. Il metodo include le combinazioni di fluoroforo utilizzate, passaggi dettagliati per la colorazione dei tessuti congelati del topo e dell’uomo e le procedure di scansione, acquisizione e analisi. Per l’analisi della colorazione, viene utilizzato un sistema di imaging a fluorescenza multispettrale semiautomatico disponibile in commercio. Attraverso questo metodo, fino a sei diversi marcatori sono stati macchiati e rilevati in una singola sezione di tessuto congelato. Il software di analisi dell’apprendimento automatico può fenotipo le cellule che possono essere utilizzate per l’analisi quantitativa. Il metodo qui descritto per i tessuti congelati è utile per il rilevamento di marcatori che non possono essere rilevati nei tessuti FFPE o per i quali anticorpi non sono disponibili per i tessuti FFPE.

Introduction

I recenti progressi nelle tecniche di imaging microscopico hanno migliorato significativamente le nostre conoscenze e la comprensione dei processi biologici e degli stati della malattia. Il rilevamento in situ delle proteine nei tessuti tramite immunohistochimica cromogenica (IHC) viene regolarmente eseguito in patologia. Tuttavia, il rilevamento di più marcatori che utilizzano la colorazione IHC cromogenica è difficile¹ e metodi più recenti per utilizzare approcci di colorazione multifluorescenza (mIF), in cui più marcatori biologici sono etichettati su un singolo campione di tessuto, sono in fase di sviluppo. La rilevazione di più marcatori biologici è utile, perché le informazioni relative all’architettura dei tessuti, alla distribuzione spaziale delle cellule e alla co-espressione dell’antigene sono tutte catturate in un campione di tessuto singolo². L’uso della tecnologia di imaging a fluorescenza multispettrale ha reso possibile il rilevamento di più marcatori biologici. In questa tecnologia, utilizzando ottiche specifiche, gli spettri di fluorescenza di ogni singolo fluoroforo possono essere separati o “non miscelati”, consentendo il rilevamento di più marcatori senza alcun crosstalk spettrale³. L’imaging a fluorescenza multispettrale sta diventando un approccio critico nella biologia cellulare, nello sviluppo di farmaci preclinici, nella patologia clinica e nella profilazione immunitaria del tumore^4,5,6. È importante sottolineare che la distribuzione di cellule immunitarie (in particolare le cellule T CD8) può servire come fattore prognostico per i pazienti con tumori esistenti⁷.

Sono stati sviluppati vari approcci alla colorazione a fluorescenza multiplex che possono essere eseguiti contemporaneamente o in sequenza. Nel metodo di colorazione simultanea, tutti gli anticorpi vengono aggiunti insieme come cocktail in un unico passaggio per etichettare il tessuto. La tecnologia UltraPlex utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati seguiti da un cocktail di anticorpi secondari anti-hapten anti-hapten confluito con fluoroforo. La tecnologia InSituPlex⁸ utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati in DNA unici che vengono aggiunti contemporaneamente al tessuto seguito da un passo di amplificazione e infine sonde coniugate a fluoroforo che sono complementari a ogni sequenza di DNA unica sull’anticorpo primario. Entrambe queste tecnologie consentono il rilevamento di quattro marcatori più 4′,6-diamino-2-fenilindole (DAPI) per la colorazione nucleare. Altri due approcci per la colorazione multiplex simultanea si basano sulla spettrometria di massa iomaci^{secondaria 9}. Hyperion Imaging System utilizza la citometria di massa¹⁰ per rilevare fino a 37 marcatori. Questa tecnologia utilizza un cocktail di anticorpi coniugati in metallo per macchiare i tessuti, e specifiche aree dei tessuti sono ablatate da un laser e trasferite in un citometro di massa dove vengono rilevati gli ioni metallici. Un’altra tecnologia simile è l’IONPath, che utilizza la tecnologia di imaging del fascio di ioni multiplexed¹¹. Questa tecnologia utilizza uno strumento di spettrometria di massa modificato e una fonte di ioni di ossigeno invece del laser per ablate gli anticorpi coniugati in metallo. Mentre tutti questi approcci di colorazione multiplex simultanei consentono il rilevamento di più marcatori, i costi per coniugare DNA, apteni o metalli agli anticorpi, la perdita di tessuto a causa dell’ablazione e l’estesa elaborazione delle immagini per lo smistamento non possono essere sottovalutati. Inoltre, i kit e i protocolli di colorazione sono attualmente disponibili solo per i tessuti FFPE e lo sviluppo di pannelli personalizzati comporta tempi e spese aggiuntivi.

Il metodo di colorazione multiplex sequenziale, al contrario, include l’etichettatura del tessuto con un anticorpo a un marcatore, stripping per rimuovere l’anticorpo, seguita da ripetizioni sequenziali di questo processo per etichettare più marcatori¹². L’amplificazione del segnale di tirofa (TSA) è il metodo di multiplexing sequenziale più utilizzato. Altre due tecnologie di multiplexing utilizzano una combinazione di metodi di colorazione simultanei e sequenziali. La piattaforma CODEX¹³ impiega un cocktail di anticorpi coniugati a sequenze uniche di oligonucleotidi di DNA che alla fine vengono etichettate con un fluoroforo utilizzando una fase di polimerizzazione indicizzata seguita dall’imaging, dallo stripping e dalla ripetizione del processo per rilevare fino a 50 marcatori. L’approccio di colorazione multiplex MultiOmyx¹⁴ è un’iterazione di colorazione con un cocktail di tre o quattro anticorpi coniugati con fluoroforo, imaging, spegnimento dei fluorofori e ripetizione di questo ciclo per rilevare fino a 60 marcatori su una singola sezione. Simile al metodo di colorazione multiplex simultanea, mentre è possibile rilevare un’ampia gamma di marcatori, il tempo necessario per la colorazione, l’acquisizione dell’immagine, l’elaborazione e l’analisi è ampio. La fase di stripping/spegnimento comporta il riscaldamento e/o lo sbiancamento del campione di tessuto e, pertanto, l’approccio di colorazione multiplex sequenziale viene comunemente eseguito sui tessuti FFPE che mantengono l’integrità dei tessuti al riscaldamento o allo sbiancamento.

La fissazione della formalina e il successivo incorporamento della paraffina vengono prontamente eseguiti in un ambiente clinico, i blocchi di tessuto sono facili da memorizzare e sono disponibili diversi protocolli di colorazione multiplex. Tuttavia, l’elaborazione, l’incorporamento e la deparaffinazione dei tessuti FFPE, così come il recupero dell’antigene¹⁵, un processo attraverso il quale gli anticorpi possono accedere meglio agli epitopi, richiede molto tempo. Inoltre, l’elaborazione coinvolta nei tessuti FFPE contribuisce all’autofluorescenza¹⁶ e maschera gli epitopi bersaglio, con conseguente variabilità e mancanza di clone di anticorpi disponibili per rilevare gli antigeni nei tessuti FFPE^17,18,19. Un esempio è l’antigene di leucocito umano (HLA) di classe I alleli²⁰. Al contrario, lo scatto di congelamento dei tessuti non comporta lunghe fasi di elaborazione prima o dopo il fissaggio, eludendo la necessità di recupero dell’antigene^21,22e rendendolo vantaggioso per rilevare una più ampia gamma di obiettivi. Pertanto, l’utilizzo di tessuti congelati per l’imaging a fluorescenza multispettrale può essere utile per rilevare obiettivi per studi preclinici e clinici.

Date le limitazioni di cui sopra quando si utilizzano tessuti FFPE, ci siamo chiesti se l’imaging a fluorescenza multispettrale può essere eseguito su tessuti congelati. Per rispondere a questa domanda, abbiamo testato un metodo di colorazione multiplex simultaneo utilizzando un pannello di anticorpi coniugati a fluoroforo per rilevare più antigeni e analizzato la colorazione utilizzando un sistema di imaging multispettrale semiautomatico. Siamo stati in grado di macchiare simultaneamente fino a sei marcatori in una singola sezione di tessuto entro 90 min.

Protocol

La milza del topo e i tessuti tumorali del topo HLF1623 sono stati ottenuti dal nostro laboratorio. Il tessuto tonsillare umano è stato acquistato da un fornitore commerciale. I dettagli sono forniti nella Tabella dei Materiali. 1. Incorporamento dei tessuti Incorporare tessuti freschi nella soluzione OCT (temperatura di taglio ottimale) e congelare con lo snap utilizzando ghiaccio secco o azoto liquido. Conservare i tessuti a -80 g…

Representative Results

Rilevamento di marcatori a macchia singola su sezioni di milza congelatePoiché il sistema di imaging semiautomatico utilizza un sistema di filtri regolabili a cristalli liquidi (LCTF) che consente una più ampia gamma di rilevamento della lunghezza d’onda25, e poiché non sono stati eseguiti passaggi di amplificazione del segnale qui, abbiamo prima ottimizzato il rilevamento dei nostri anticorpi coniugati primari per ogni marcatore al microscopio. Un esempio è illustrato nel…

Discussion

I tessuti congelati sono stati ampiamente utilizzati per l’imaging mIF per rilevare tradizionalmente da tre a quattro marcatori³¹ su un tessuto utilizzando il metodo diretto e indiretto³². Nel metodo diretto, gli anticorpi sono coniugati a coloranti fluorescenti o punti quantici³³ per etichettare il tessuto, mentre nel metodo indiretto, un anticorpo primario non coniugato viene utilizzato per etichettare il tessuto seguito da un anticorpo secondario …

Materials

Acetone (histological grade)	Fisher Scientific	A16F-1GAL	Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3	BioLegend	100212	Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20	ThermoFisher Scientific	53-0202-82	Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67	BD Biosciences	558617	Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3	BioLegend	300446	Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a	BioLegend	100758	Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a	BioLegend	372906	Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)	BioLegend	141711	Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody	BioLegend	100426	Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse	Charles River Laboratories	27	Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar	Sigma Aldrich	S6016-6EA	Rehydrating and washing slides
DAPI Solution	BD Biosciences	564907	Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides	DOT Scientific	DW7590W	Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)	Fisher Scientific	MT21031CV	Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips	ThermoFisher Scientific	3306	Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block	AMSBio	AMS6023	Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X	Gemini Bio-Products	100-512	Blocking and diluent for human tissues
inForm	Akoya Biosciences	Version 2.4.1	Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4	BioLegend	300529	Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	550993	Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart	Akoya Biosciences	Version 1.0.8	Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36965	Mounting medium
Research Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S	Sectioning tissues
Superblock 1X	ThermoFisher Scientific	37515	Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution	Sakura Finetek	4583	Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide	Akoya Biosciences	CLS142568	Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software	Akoya Biosciences	Version 3.0.5	Software to operate microscope