JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Быстрый метод многоспектральной флуоресценции Визуализация замороженных секций тканей

Published: March 30, 2020
doi:
10.3791/60806
, , ,
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, 2Department of Pathology,University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University

Summary

Мы описываем быстрый метод окрашивания для выполнения многоспектральной визуализации замороженных тканей.

Abstract

Многоспектральная флуоресценция на ткани с фиксированным парафином (FFPE) позволяет обнаружить несколько маркеров в одном образце ткани, которые могут предоставить информацию о антигенной коэкспрессии и пространственном распределении маркеров. Однако отсутствие подходящих антител для формалино-фиксированных тканей может ограничить характер маркеров, которые могут быть обнаружены. Кроме того, метод окрашивания занимает много времени. Здесь мы описываем быстрый метод выполнения многоспектральной флуоресценции изображения замороженных тканей. Метод включает в себя используемые комбинации фторофора, подробные шаги для окрашивания мыши и замороженных тканей человека, а также процедуры сканирования, приобретения и анализа. Для анализа окрашивания используется коммерчески доступная полуспектральная многоспектральная флуоресценционная система визуализации. С помощью этого метода, до шести различных маркеров были окрашены и обнаружены в одном разделе замороженных тканей. Программное обеспечение для анализа машинного обучения может использовать фенотипные клетки, которые могут быть использованы для количественного анализа. Описанный здесь метод для замороженных тканей полезен для обнаружения маркеров, которые не могут быть обнаружены в тканях FFPE или для которых антитела не доступны для тканей FFPE.

Introduction

Последние достижения в области микроскопических методов визуализации значительно улучшили наши знания и понимание биологических процессов и состояний болезней. При анализе белков в тканях с помощью хромогенной иммуногистохимии (МГК) обычно проводится при патологии. Тем не менее, обнаружение нескольких маркеров с использованием хромогенных iHC окрашивания является сложнойзадачей 1 и новые методы для использования мультиплекс иммунофлуоресценции (mIF) окрашивания подходов, в котором несколько биологических маркеров помечены на одном образце ткани, разрабатываются. Обнаружение нескольких биологических маркеров полезно, потому что информация, связанная с архитектурой тканей, пространственным распределением клеток и антигеном, все они запечатлены в одной образце ткани2. Использование многоспектральной технологии визуализации флуоресценции сделало возможным обнаружение нескольких биологических маркеров. В этой технологии, используя определенную оптику флуоресценции спектры каждого отдельного флюорофора могут быть разделены или “несмешанные”, что позволяет обнаружение нескольких маркеров без каких-либо спектральныхперекрестного3 . Многоспектральная флуоресценция становится критическим подходом в клеточной биологии, доклиническом развитии лекарственных средств, клинической патологии и иммунном профилировании опухоли4,,5,6. Важно отметить, что пространственное распределение иммунных клеток (в частности, CD8 Т-клеток) может служить прогностическим фактором для пациентов с существующими опухолями7.

Разработаны различные подходы к расклеиванию мультиплексной флуоресценции, которые могут выполняться одновременно или последовательно. В методе одновременного окрашивания все антитела добавляются вместе, как коктейль в один шаг, чтобы обозначить ткани. Технология UltraPlex использует коктейль из хаптен-конъюгированных первичных антител, за которым и коктейль из флюорофора-конъюгированных анти-хаптеновых вторичных антител. Технология InSituPlex8 использует коктейль из уникальных ДНК-конъюгированных первичных антител, которые одновременно добавляются в ткани с последующим шагом усиления и, наконец, флюорофор-конъюгированными зондами, которые дополняют каждую уникальную последовательность ДНК на первичном антителе. Обе эти технологии позволяют обнаружить четыре маркера плюс 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) для ядерного окрашивания. Два других подхода к одновременному окрашиванию мультиплексного окрашиваемого основанного на вторичной ионной масс-спектрометрии9. Система визуализации Hyperion использует цитометрию массы изображения10 для обнаружения до 37 маркеров. Эта технология использует коктейль из металлических конъюгированных антител, чтобы запятнать ткани, а определенные участки тканей абляции лазером и передаются в массовый цитометр, где обнаружены ионы металла. Другой аналогичной технологией является IONPath, который использует мультиплексный ионный луч изображения технологии11. Эта технология использует модифицированный инструмент масс-спектрометрии и источник ионного кислорода вместо лазера, чтобы абляции металлических конъюгированных антител. В то время как все эти одновременные мультиплексные подходы к окрашиванию позволяют обнаруживать несколько маркеров, нельзя недооценивать затраты на спряжение ДНК, гастенили или металлов к антителам, потерю ткани из-за абляции и обширную обработку изображений для несмешивания. Кроме того, комплекты и протоколы окрашивания в настоящее время доступны только для тканей FFPE и разработка пользовательских панелей влечет за собой дополнительное время и расходы.

Последовательный метод окрашивания мультиплексов, напротив, включает в себя маркировку ткани антителом к одному маркеру, зачистку для удаления антител, а затем последовательные повторы этого процесса для обозначения нескольких маркеров12. Усиление сигнала тирамад (TSA) является наиболее часто используемым методом последовательного мультиплексирования. Две другие технологии мультиплексирования используют сочетание одновременных и последовательных методов окрашивания. Платформа CODEX13 использует коктейль антител, спрягаемых с уникальными последовательностями олигонуклеотидов ДНК, которые в конечном итоге помечены флюорофором с помощью индексируемого шага полимеризации, за которым следуют визуализация, зачистка и повторение процесса обнаружения до 50 маркеров. Мультиомикс мультиплексок окрашивания подход14 является итерация окрашивания с коктейлем из трех-четырех флюорофор-конъюгированных антител, изображения, угасание фторфоров, и повторение этого цикла для обнаружения до 60 маркеров на одном разделе. Подобно методу одновременного мультиплексного окрашивания, в то время как широкий спектр маркеров может быть обнаружен, время, связанное с окрашиванием, приобретением изображений, обработкой и анализом, обширено. Зачистка / закалка шаг включает в себя отопление и / или отбеливание образца ткани и, таким образом, последовательный мультиплекс окрашивания подход обычно осуществляется на ткани FFPE, которые поддерживают целостность тканей при нагревании или отбеливание.

Формалин фиксации и последующего встраивания парафина легко выполняется в клинических условиях, ткани блоки легко хранить, и несколько протоколов мультиплекс окрашивания доступны. Тем не менее, обработка, встраивание и депарафинизация тканей FFPE, а также антигена поиска15, процесс, с помощью которого антитела могут лучше получить доступ к эпитопам, занимает много времени. Кроме того, обработка, связанная с тканями FFPE, способствует аутофлуоресценции16 и маски целевых эпитопов, что приводит к изменчивости и отсутствию клона антител, доступных для обнаружения антигенов в тканях FFPE17,18,19. Примером является человеческий лейкоцит антиген (HLA) класса я аллелей20. В отличие от этого, оснастки замораживания тканей не включает в себя обширные шаги обработки до или после фиксации, в обход необходимости поиска антигена21,22, и делает его полезным для обнаружения более широкого круга целей. Поэтому использование замороженных тканей для многоспектральной флуоресценции может быть полезным для выявления целей для доклинических и клинических исследований.

Учитывая вышеупомянутые ограничения при использовании тканей FFPE, мы спросили, можно ли проводить многоспектральную флуоресценцию на замороженных тканях. Для решения этого вопроса мы протестировали метод одноразового мультиплексного окрашивания с помощью панели флюорофор-конъюгированных антител для обнаружения нескольких антигенов и проанализировали окрашивание с помощью полуавтоматической многоспектральной системы визуализации. Мы смогли одновременно пятно до шести маркеров в одной секции ткани в течение 90 минут.

Protocol

Мышь селезенки и HLF16 мыши опухоли тканей23 были получены из нашей лаборатории. Ткань миндалин человека была приобретена у коммерческого поставщика. Подробности приведены в таблице материалов. 1. Встраивание тканей Встраивай свежую ткань в раст?…

Representative Results

Обнаружение одноразовых маркеров на замороженных секциях селезенкиПоскольку полуавтоматизированная система визуализации использует систему жидкокристаллического tunable filter (LCTF), которая позволяет более широкий диапазон обнаружения длинволн25,и потому, что не ?…

Discussion

Замороженные ткани широко используются для визуализации mIF традиционно обнаружить от трех до четырех маркеров31 на ткани с помощью прямого и косвенногометода 32. В прямом методе, антитела спрягаются к флуоресцентным красителям или квантовым точкам33</s…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Руководство по визуализации и анализу было предоставлено Исследовательским центром ресурсов – Научно-исследовательская гистологическая и тканевая визуализация ядра в Университете Иллинойса в Чикаго, созданная при поддержке офиса вице-канцлера по исследованиям. Работа была поддержана NIH/NCI RO1CA191317 в CLP, NIH/NIAMS (SBDRC грант 1P30AR075049-01) д-р А. Паллер, а также при поддержке Роберт Х. Лурье Всеобъемлющий онкологический центр для иммунотерапии оценки ядра в Северо-Западном университете.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Pesquisa do Câncer. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

Tags

Multispectral Fluorescence ImagingBiomarker DetectionCo-localizationRapid Staining MethodSpectral LibraryMachine LearningImage Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image