JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

En rask metode for multispektral fluorescens avbildning av frosne vevseksjoner

Published: March 30, 2020
doi:
10.3791/60806
, , ,
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, 2Department of Pathology,University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University

Summary

Vi beskriver en rask fargingsmetode for å utføre multispektral avbildning på frosne vev.

Abstract

Multispektral fluorescensavbildning på formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev gjør det mulig å oppdage flere markører i en enkelt vevsprøve som kan gi informasjon om antigenkouttrykk og romlig fordeling av markørene. Imidlertid kan mangel på egnede antistoffer for formalin-fikset vev begrense arten av markører som kan oppdages. I tillegg er fargemetoden tidkrevende. Her beskriver vi en rask metode for å utføre multispektral fluorescensavbildning på frosne vev. Metoden inkluderer fluoroforen kombinasjoner som brukes, detaljerte trinn for farging av mus og menneskelig frosset vev, og skanning, oppkjøp og analyse prosedyrer. For fargingsanalyse brukes et kommersielt tilgjengelig semiautomatisert multispektralt fluorescensbildesystem. Gjennom denne metoden ble opptil seks forskjellige markører farget og oppdaget i en enkelt frossen vevsseksjon. Maskinlæringsanalyseprogramvaren kan fenotypeceller som kan brukes til kvantitativ analyse. Metoden som er beskrevet her for frosne vev er nyttig for påvisning av markører som ikke kan oppdages i FFPE vev eller som antistoffer ikke er tilgjengelige for FFPE vev.

Introduction

Nylige fremskritt innen mikroskopiske bildeteknikker har betydelig forbedret vår kunnskap og forståelse av biologiske prosesser og sykdomstilstander. Ved situ påvisning av proteiner i vev via kromogen immunohistochemistry (IHC) utføres rutinemessig i patologi. Imidlertid er påvisning av flere markører ved hjelp av kromogen IHC farging utfordrende1 og nyere metoder for å bruke multipleks immunofluorescens (mIF) farging tilnærminger, karakterisert ved at flere biologiske markører er merket på en enkelt vevsprøve, blir utviklet. Påvisning av flere biologiske markører er nyttig, fordi informasjon relatert til vevsarkitektur, romlig fordeling av celler og antigenkouttrykk er alle fanget i en enkelt vevsprøve2. Bruken av multispektral fluorescensbildeteknologi har gjort påvisning av flere biologiske markører mulig. I denne teknologien, ved hjelp av spesifikk optikk fluorescensspektra av hver enkelt fluoroforfor kan skilles eller “ublandet”, slik at påvisning av flere markører uten spektral crosstalk3. Multispektral fluorescensavbildning blir en kritisk tilnærming i cellebiologi, preklinisk legemiddelutvikling, klinisk patologi og tumorimmunprofilering4,5,6. Viktigere, spacial fordeling av immunceller (spesielt CD8 T celler) kan tjene som en prognostisk faktor for pasienter med eksisterende svulster7.

Ulike tilnærminger til multipleks fluorescens farging er utviklet og kan utføres enten samtidig eller sekvensielt. I den samtidige fargemetoden legges alle antistoffene sammen som en cocktail i et enkelt trinn for å merke vevet. UltraPlex-teknologi bruker en cocktail av hapten-konjugerte primære antistoffer etterfulgt av en cocktail av fluorofofan-konjugerte anti-hapten sekundære antistoffer. InSituPlex-teknologi8 bruker en cocktail av unike DNA-konjugerte primære antistoffer som samtidig legges til vevet etterfulgt av et forsterkningstrinn og til slutt fluoroforiske konjugerte sonder som er komplementære til hver unike DNA-sekvens på det primære antistoffet. Begge disse teknologiene gjør det mulig å oppdage fire markører pluss 4′,6-diamino-2-fenylindzol (DAPI) for kjernefysisk farging. To andre tilnærminger for samtidig multipleksfarging er basert på sekundær ionmassespektrometri9. Hyperion Imaging System bruker bildemasse cytometri10 for å oppdage opptil 37 markører. Denne teknologien bruker en cocktail av metall-konjugerte antistoffer for å flekke vevet, og bestemte områder av vevet er ablated av en laser og overføres til et massecytometer hvor metallionene oppdages. En annen lignende teknologi er IONPath, som bruker multipleksert ion strålebildeteknologi11. Denne teknologien bruker et modifisert massespektrometriinstrument og en oksygenionkilde i stedet for laser for å ablate metallkonjugerte antistoffer. Mens alle disse samtidige multipleksfargingsmetodene muliggjør påvisning av flere markører, kan kostnadene som er involvert for å konjugere DNA, haptens eller metaller til antistoffer, tap av vev på grunn av ablasjon og omfattende bildebehandling for unmixing ikke undervurderes. Videre er sett og fargingprotokoller for tiden bare tilgjengelige for FFPE-vev, og utvikling av tilpassede paneler innebærer ekstra tid og utgifter.

Den sekvensielle multipleksfarfargingsmetoden, derimot, inkluderer merking av vevet med et antistoff mot en markør, stripping for å fjerne antistoffet, etterfulgt av sekvensielle gjentakelser av denne prosessen for å merke flere markører12. Tyramidsignalforsterkningen (TSA) er den mest brukte sekvensielle multipleksjonsmetoden. To andre multipleksingsteknologier bruker en kombinasjon av samtidige og sekvensielle fargingsmetoder. CODEX-plattformen13 benytter en cocktail av antistoffer som er konjugert til unike DNA oligonucleotide sekvenser som til slutt er merket med en fluorofor i bruk av et indeksert polymeriseringstrinn etterfulgt av avbildning, stripping og gjentaprosessen for å oppdage opptil 50 markører. MultiOmyx multiplex farging tilnærming14 er en iterasjon av farging med en cocktail av tre til fire fluorofor-konjugerte antistoffer, bildebehandling, slukke fluoroforer, og gjenta denne syklusen for å oppdage opptil 60 markører på en enkelt seksjon. I likhet med den samtidige multipleksfargingsmetoden, mens et bredt spekter av markører kan oppdages, er tiden som er involvert i farging, bildeoppkjøp, behandling og analyse omfattende. Stripping / slukking trinn innebærer oppvarming og / eller bleking vevprøven og dermed den sekvensielle multipleks farging tilnærming er ofte utført på FFPE vev som opprettholder vev integritet ved oppvarming eller bleking.

Formalin fiksering og påfølgende parafin innebygging utføres lett i en klinisk setting, vev blokker er lett å lagre, og flere multipleks farging protokoller er tilgjengelig. Imidlertid er behandlingen, innebygging og deparaffinisering av FFPE vev, samt antigen gjenfinning15, en prosess der antistoffer bedre kan få tilgang til epitoper, tidkrevende. Videre bidrar behandlingen involvert i FFPE vev til autofluorescens16 og masker mål epitoper, noe som resulterer i variabilitet og mangel på antistoff klone tilgjengelig for å oppdage antigener i FFPE vev17,18,19. Et eksempel er humant leukocytter antigen (HLA) klasse jeg alleles20. I motsetning innebærer snap frysing av vev ikke omfattende behandlingstrinn før eller etter fiksering, omgå behovet for antigen henting21,22, og gjør det gunstig for å oppdage et bredere spekter av mål. Derfor kan bruk av frosne vev for multispektral fluorescensavbildning være verdifullt for å oppdage mål for prekliniske og kliniske studier.

Gitt de ovennevnte begrensningene ved bruk av FFPE vev, spurte vi om multispektral fluorescensavbildning kan utføres på frosne vev. For å løse dette spørsmålet testet vi en samtidig multipleksfargingsmetode ved hjelp av et panel av fluorofor-konjugerte antistoffer for å oppdage flere antigener og analyserte farging ved hjelp av et halvautomatisert multispektralt bildesystem. Vi var i stand til å samtidig farge opp til seks markører i en enkelt vev seksjon innen 90 min.

Protocol

Mus milt og HLF16 mus tumor vev23 ble hentet fra vårt laboratorium. Menneskelig mandlene vev ble kjøpt fra en kommersiell leverandør. Detaljer er gitt i materialtabellen. 1. Vevsinnebygging Bygg inn friskt vev i OCT (optimal skjæretemperatur) løsning og snap fryse ved hjelp av enten tørris eller flytende nitrogen. Oppbevar vevet ved -80 °C. 2. Kryoseksjon Skjær 8 μm seksjoner i en …

Representative Results

Påvisning av enkeltfargede markører på frosne miltseksjonerSom det halvautomatiske bildebehandlingssystemet bruker et flytende krystalltunablefilter (LCTF) system som gjør det mulig for et bredere spekter av bølgelengdedeteksjon25, og fordi ingen signalforsterkningstrinn ble utført her, optimaliserte vi først påvisning av våre primære konjugerte antistoffer for hver markør på mikroskopet. Et eksempel vises i figur 1, der hver enkeltfar…

Discussion

Frosne vev har i stor grad blitt brukt til mIF-avbildning for tradisjonelt å oppdage tre til fire markører31 på et vev ved hjelp av den direkte og indirekte metoden32. I den direkte metoden blir antistoffer konjugert til fluorescerende fargestoffer eller kvanteprikker33 for å merke vevet, mens i den indirekte metoden brukes et ukonjugert primært antistoff til å merke vevet etterfulgt av et fluorofhore-konjugert sekundært antistoff som spesifik…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Imaging og analyse veiledning ble gitt av Research Resources Center – Research Histology og Tissue Imaging Core ved University of Illinois i Chicago etablert med støtte fra kontoret til visekansler for forskning. Arbeidet ble støttet av NIH/NCI RO1CA191317 til CLP, av NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) til Dr. A. Paller, og ved støtte fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center til Immunotherapy Assessment Core ved Northwestern University.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Pesquisa do Câncer. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

Tags

Multispectral Fluorescence ImagingBiomarker DetectionCo-localizationRapid Staining MethodSpectral LibraryMachine LearningImage Analysis
check_url/pt/60806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image