التكيف المغناطيسي للحمولة اللاحقة في أنسجة القلب المهندسة
Summary
يوفر هذا البروتوكول طرقًا تفصيلية تصف تصنيع وتنفيذ منصة ضبط ما بعد التحميل المستندة إلى المغناطيسية لأنسجة القلب المهندسة.
Abstract
ومن المعروف بعد الحمل لدفع تطور كل من الحالات الفسيولوجية والقلبية المرضية. وعلى هذا النحو، فإن دراسة نتائج الدول التي تم تغييرها بعد التحميل يمكن أن تسفر عن رؤى مهمة حول الآليات التي تتحكم في هذه العمليات الحرجة. ومع ذلك، هناك حاجة حاليا ً إلى تقنية تجريبية لضبط الحمل اللاحقة بدقة في أنسجة القلب مع مرور الوقت. هنا ، يتم وصف تقنية مغناطيسية حديثة التطوير لتحقيق هذه السيطرة في أنسجة القلب المهندسة (EHTs). من أجل إنتاج EHTs تستجيب مغناطيسيا (MR-EHTs)، يتم تركيب الأنسجة على وظائف سيليكون جوفاء، وبعضها يحتوي على مغناطيس دائم صغير. مجموعة ثانية من المغناطيس الدائم هو الصحافة تناسب في لوحة الاكريليك بحيث يتم توجيهها مع نفس القطبية ومحوري الانحياز مع المغناطيس آخر. لضبط ما بعد الحمل، يتم ترجمة هذه اللوحة من المغناطيس نحو (أعلى بعد الحمل) أو بعيدا (أقل بعد الحمل) من المغناطيس آخر باستخدام مرحلة بيزوكهربائية مزودة الترميز. برنامج التحكم في الحركة المستخدمة لضبط تحديد المواقع المرحلة يسمح لتطوير أنظمة الحمل بعد المعرفة من قبل المستخدم في حين أن الترميز يضمن أن المرحلة يصحح لأي تناقضات في موقعها. يصف هذا العمل تصنيع ومعايرة وتنفيذ هذا النظام لتمكين تطوير منصات مماثلة في مختبرات أخرى في جميع أنحاء العالم. يتم تضمين النتائج التمثيلية من تجربتين منفصلتين لتجسيد مجموعة الدراسات المختلفة التي يمكن إجراؤها باستخدام هذا النظام.
Introduction
بعد التحميل هو الحمل الانقباضي على البطين بعد أن بدأت في إخراج الدم1. أثناء تطور القلب ، فإن الحمل التالي المناسب له أهمية حاسمة لنضوج عضلة القلب2. في مرحلة البلوغ، يمكن أن يؤدي انخفاض مستويات الحمل العقبي البطيني (على سبيل المثال، في المرضى طريح الفراش الذين يعانون من إصابة الحبل الشوكي عالية المستوى3 أو في حالات خاصة جدا مثل رحلة الفضاء4)إلى انخفاض في القلب. على العكس من ذلك، يمكن أن يؤدي ارتفاع الحمل اللاحقة إلى تضخم القلب5. في حين أن تضخم القلب في الرياضيين التحمل أو النساء الحوامل يعتبر مفيدًا وفسيولوجياً ، فإن تضخم الدم المرتبط بارتفاع ضغط الدم الشرياني على المدى الطويل أو تضيق الصمام الأبهري الشديد ضار لأنه يهيئ واحدًا لعدم انتظام ضربات القلب وفشل القلب6. على الرغم من أن معدل الوفيات لمدة 5 سنوات لمرضى قصور القلب قد انخفض من حوالي 70٪ في 1980s6 إلى 40-50٪7 في الوقت الحاضر، لا تزال هناك حاجة كبيرة لخيارات العلاج العلاجية الجديدة لهذه الحالة السائدة للغاية (حاليا 2.2٪ من السكان في العالم الغربي)8.
من أجل التحقيق في الآليات الجزيئية للتضخم القلبي المرضي واختبار الاستراتيجيات الوقائية أو العلاجية لعلاج هذا المرض ، في الجسم الحي نماذج من الحمل اللاحقة تمتطويرها 9،10،11،12. في حين أن هذه النماذج قد قدمت رؤى مفيدة في آثار الحمل اللاحقة على أداء البطين، فإنها لا تسمح للسيطرة الدقيقة على حجم ما بعد الحمل. بدلا من ذلك, في المختبر دراسات ما بعد الحمل الذي أجريت على قلوب مكوس واستعدادات العضلات تسمح للسيطرة الدقيقة على تحميل الأنسجة, ولكن هذه النماذج ليست مواتية للدراسات الطولية13,,14,,15.
للتغلب على هذه القضايا، وضعنا نموذجا في المختبر من ارتفاع بعد الحمل في أنسجة القلب المهندسة (EHTs)16،17. هذا النموذج هو تنسيق الثقافة 3 الأبعاد لخلايا قلب الفئران جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الفيبرين علقت بين وظائف سيليكون مجوفة مرنة. هذه الأنسجة فاز تلقائيا (ضد مقاومة وظائف السيليكون) وأداء العمل auxotonic. لقد قمنا بزيادة الحمل اللاحقة المطبقة على EHTs بعامل 12 في التجارب السابقة عن طريق إدخال الأقواس المعدنية الجامدة في وظائف السيليكون الجوفاء لمدة أسبوع واحد. أدى هذا إلى العديد من التغييرات ، وهي سمة من سمات تضخم القلب المرضي18،19،20: تضخم عضلة القلب ، النضوب الجزئي ، انخفاض في قوة العقد ، ضعف استرخاء الأنسجة ، إعادة تنشيط برنامج جين الجنين ، تحول استقلابي من أكسدة الأحماض الدهنية إلى الجليكوز اللاهوائي ، وزيادة في التليف. على الرغم من أن هذا الإجراء قد استخدمت بنجاح في العديد من الدراسات17،21،22، لديها بعض العيوب. هناك دولتان فقط، منخفضة أو عالية جداً (12 مرة) بعد الحمل، ويتطلب الإجراء التعامل اليدوي مع EHTs، مما يحد من مرونته الزمنية ويشكل خطر التلوث.
في الآونة الأخيرة، ليونارد وآخرون استخدام تقنية مماثلة لتعديل الحمل اللاحقة في EHTs المستزرعة على وظائف السيليكون23. تم وضع أقواس ذات أطوال مختلفة حول الجزء الخارجي من المشاركات لتقييد حركة الانحناء الخاصة بها. أفاد مؤلفو هذه الدراسة أن زيادة فريدة من صغيرة إلى متوسطة في تطوير القوة المعززة ونضوج EHTs المشتقة من iPS البشري ، في حين أن الأحمال الأعلى أدت إلى حالة مرضية. ومع ذلك ، على غرار نظامنا الخاص ، تسمح هذه التقنية فقط بزيادات مفردة في الحمل اللاحقة ، والتي يملي هاوية حجمها طول الأقواس. على هذا النحو ، لا يمكن إجراء تعديلات دقيقة في الحمل اللاحقة ، والتعديلات في التحميل اللاحقة بمرور الوقت ، وأنظمة التحميل الدقيقة مع هذه التقنيات.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول لنظام التي يمكن استخدامها لتعديل ما بعد المقاومة، أي بعد حمولة من EHTs مغناطيسيا24. تسهل هذه المنصة ضبط الحمل اللاحقة ، وتمكن أنظمة التحميل اللاحقة المعرفة من قبل المستخدم ، وتضمن عقم EHT.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المبين هنا تقنية جديدة لتغيير الحمل اللاحقة مغناطيسيًا في أنسجة القلب المهندسة. تعتمد هذه التقنية على استخدام مرحلة بيزوكهربائية لترجمة لوحة من المغناطيس القوي نحو وبعيدا ً عن رفوف السيليكون المستجيبة مغناطيسياً. كلما اقتربت مجموعتين من المغناطيس ، كلما كانت الحمولة الل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر جوتا ستارباتي لدعمها في العمل ثقافة الأنسجة، أكسل كيرشيف للتصوير الفوتوغرافي، أليس كازاغراند سيسوونتو لأعمال التحرير، وشكر خاص لبولنت Aksehirlioglu للدعم التقني في تطوير هذا الجهاز. بدعم B.B. من قبل DZHK (المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية) منحة الباحث، M.L.R. من قبل منحة العالم في مرحلة ما بعد الدكتوراه منحة وويتيكر وM.N.H. من أموال من DZHK.
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
Referências
- Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. . Braunwald’s Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).
- McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).
- de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).
- Perhonen, M. A., et al. Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).
- Levy, D., et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
- Maggioni, A. P., et al. EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot). European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29 (2015).
- Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation. Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).
- Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload. The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).
- Toischer, K., et al. Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).
- Zhang, H., et al. Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload. PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).
- Hori, M., et al. Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart. The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).
- Schotola, H., et al. The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload. ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).
- Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. Afterload as a primary determinat of ventricular performance. The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Hirt, M. N., et al. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).
- Dorn, G. W. The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy. Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).
- Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
- Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).
- Stenzig, J., et al. DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors. Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).
- Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue. Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).
- Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
- Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).
- Mannhardt, I., et al. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).
