Ajuste magnético de la carga posterior en los tejidos cardíacos diseñados
Summary
Este protocolo proporciona métodos detallados que describen la fabricación e implementación de una plataforma de ajuste de la carga posterior basada en magnéticos para tejidos cardíacos diseñados.
Abstract
Se sabe que la carga posterior impulsa el desarrollo de estados cardíacos fisiológicos y patológicos. Como tal, el estudio de los resultados de los estados alterados de la carga posterior podría proporcionar información importante sobre los mecanismos que controlan estos procesos críticos. Sin embargo, actualmente falta una técnica experimental para afinar con precisión la descarga posterior en el tejido cardíaco con el tiempo. Aquí, se describe una técnica basada en magnéticos recientemente desarrollada para lograr este control en tejidos cardíacos de ingeniería (EHT). Con el fin de producir EHT magnéticamente sensibles (MR-HIF), los tejidos se montan en postes de silicona huecos, algunos de los cuales contienen pequeños imanes permanentes. Un segundo conjunto de imanes permanentes se ajusta a presión en una placa de acrílico de tal manera que están orientados con la misma polaridad y están alineados axialmente con los imanes de poste. Para ajustar la carga posterior, esta placa de imanes se traduce hacia (mayor carga posterior) o lejos (carga posterior inferior) de los imanes de poste utilizando una etapa piezoeléctrica equipada con un codificador. El software de control de movimiento utilizado para ajustar el posicionamiento de la etapa permite el desarrollo de regímenes de postcarga definidos por el usuario, mientras que el codificador garantiza que la etapa corrige cualquier incoherencia en su ubicación. Este trabajo describe la fabricación, calibración e implementación de este sistema para permitir el desarrollo de plataformas similares en otros laboratorios de todo el mundo. Se incluyen resultados representativos de dos experimentos separados para ejemplificar la gama de diferentes estudios que se pueden realizar con este sistema.
Introduction
Después de la carga es la carga sistólica en el ventrículo después de que ha comenzado a expulsar sangre1. Durante el desarrollo cardíaco, una carga posterior adecuada es de importancia crítica para la maduración de cardiomiocitos2. En la edad adulta, los niveles bajos de carga posterior ventricular (por ejemplo, en pacientes postrados en cama con lesión medular de alto nivel3 o en casos muy especiales como el vuelo espacial4) pueden dar lugar a la hipotrofia del corazón. Por el contrario, una alta carga posterior puede conducir a hipertrofia cardíaca5. Mientras que la hipertrofia cardíaca en atletas de resistencia o mujeres embarazadas se considera beneficiosa y fisiológica, la hipertrofia asociada con hipertensión arterial a largo plazo o estenosis de la válvula aórtica grave es perjudicial ya que predispone a una arritmias cardíacas e insuficiencia cardíaca6. Aunque la tasa de mortalidad a 5 años de los pacientes con insuficiencia cardíaca se ha reducido del 70% en la década de 19806 a 40–50%7 en la actualidad, todavía existe una gran necesidad de nuevas opciones de tratamiento terapéutico para esta condición altamente prevalente (actualmente 2,2% de la población en el mundo occidental)8.
Con el fin de investigar los mecanismos moleculares de la hipertrofia cardiaca patológica y probar estrategias preventivas o terapéuticas para el tratamiento de esta enfermedad, se han desarrollado modelos in vivo de poscarga99,10,,11,,12. Si bien estos modelos han ofrecido información beneficiosa sobre los efectos de la carga posterior en el rendimiento ventricular, no permiten un control fino sobre la magnitud de la carga posterior. Alternativamente, los estudios in vitro de la carga posterior realizados en corazones extirpados y preparaciones musculares permiten un control más preciso sobre la carga de tejidos, pero estos modelos no son propicios para estudios longitudinales13,,14,,15.
Para superar estos problemas, desarrollamos un modelo in vitro de postcarga elevada en tejidos cardíacos de ingeniería (EHT)16,,17. Este modelo es un formato de cultivo tridimensional para células de corazón de rata incrustadas en una matriz de fibrina suspendida entre postes de silicona huecos flexibles. Estos tejidos laten espontáneamente (contra la resistencia de los postes de silicona) y realizan trabajos auxiliares. Hemos aumentado la carga posterior aplicada a los EHT en un factor de 12 en experimentos anteriores mediante la inserción de llaves metálicas rígidas en los postes de silicona huecos durante una semana. Esto condujo a una multitud de cambios, característicos de la hipertrofia cardíaca patológica18,,19,20: hipertrofia de cardiomiocitos, necroptosis parcial, disminución de la fuerza contráctile, deterioro de la relajación tisular, reactivación del programa genético fetal, un desplazamiento metabólico de la oxidación de ácidos grasos a glucólisis anaeróbica, y un aumento de la fibrosis. Aunque este procedimiento se ha empleado con éxito en varios estudios17,21,22, tiene algunas desventajas. Sólo hay dos estados, bajo o muy alto (12 veces) después de la carga, y el procedimiento requiere el manejo manual de los EGT, lo que limita su flexibilidad temporal y plantea el riesgo de contaminación.
Recientemente, Leonard y otros utilizaron una técnica similar para modular la carga posterior en EHT cultivados en postes de silicona23. Se colocaron llaves de diferentes longitudes alrededor del exterior de los postes para restringir su movimiento de flexión. Los autores de este estudio informaron que un aumento singular de la carga de fuerza mejorada desarrollo de la fuerza y maduración de EHT derivados de iPS humanos, mientras que las cargas más altas resultaron en un estado patológico. Sin embargo, al igual que nuestro propio sistema, esta técnica sólo permite aumentos singulares en la carga posterior, cuya magnitud está dictada por la longitud de los frenos. Como tal, las alteraciones finas en la carga posterior, las modificaciones en la carga posterior a lo largo del tiempo, y los regímenes de carga precisos no son posibles con estas técnicas.
Aquí, proporcionamos el protocolo para un sistema que se puede utilizar para modular la post-resistencia, es decir, la carga posterior de EhTs magnéticamente24. Esta plataforma facilita el ajuste preciso de la carga posterior, permite los regímenes de postcarga definidos por el usuario y garantiza la esterilidad de EHT.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en este documento describe una nueva técnica para alterar magnéticamente la descarga posterior en tejidos cardíacos de ingeniería. Esta técnica se basa en el uso de una etapa piezoeléctrica para traducir una placa de imanes fuertes hacia y lejos de bastidores magnéticamente sensibles de postes de silicona. Cuanto más cerca estén los dos conjuntos de imanes, más fuerte será la carga posterior experimentada por los EHT cultivados en ellos.
Hay varios pasos que so…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Jutta Starbatty por su apoyo en el trabajo de cultivo de tejidos, Axel Kirchhof por la fotografía, Alice Casagrande Cesconetto por el trabajo de edición, y un agradecimiento especial a Aksehirlioglu por el apoyo técnico en el desarrollo de este dispositivo. B.B. fue apoyado por una beca DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), M.L.R. por una beca de beca federal postdoctoral Whitaker y M.N.H. por fondos de la DZHK.
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
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