Forbedret levedyktighet for Ex vivo 3D hydrogelkulturer av pasientavledede Xenografts i en perfused mikrofluidisk plattform

Summary

Denne protokollen demonstrerer metoder for å muliggjøre utvidet in vitro kultur av pasientavledede xenografts (PDX). Ett trinn forbedrer den generelle levedyktigheten til flercellede klyngekulturer i 3D-hydrogeler, gjennom enkel fjerning av ikke-levedyktige enkeltceller. Et sekundært trinn viser beste praksis for PDX-kultur i en perfundert mikrofluidisk plattform.

Abstract

Pasientavledede xenografter (PDX), generert når resected pasient tumorvev er engrafted direkte inn i immunkompromitterte mus, forblir biologisk stabil, og dermed bevare molekylære, genetiske, og histologiske egenskaper, samt heterogenitet av den opprinnelige svulsten. Men å bruke disse modellene til å utføre en rekke eksperimenter, inkludert narkotikascreening, er uoverkommelig både når det gjelder kostnader og tid. Tredimensjonale (3D) kultursystemer er viden sett på som plattformer der kreftceller beholder sin biologiske integritet gjennom biokjemiske interaksjoner, morfologi og arkitektur. Vårt team har lang erfaring med å kultere PDX-celler in vitro ved hjelp av 3D-matriser bestående av hyaluronsyre (HA). For å skille mus fibroblast stromal celler forbundet med PDXs, bruker vi rotasjonskultur, hvor stromale celler holder seg til overflaten av vev kulturbehandlede plater mens dissosierte PDX tumorceller flyter og selv-knyttes til flercellede klynger. Også flytende i supernatant er enkle, ofte døde celler, som presenterer en utfordring i å samle levedyktige PDX klynger for nedstrøms innkapsling i hydrogeler for 3D cellekultur. For å skille disse enkeltcellene fra levende celleklynger, har vi ansatt tetthet trinn gradient sentrifugering. Protokollen som er beskrevet her, gjør det mulig å tømme ikke-levedyktige enkeltceller fra den sunne populasjonen av celleklynger som vil bli brukt til videre in vitro eksperimentering. I våre studier inkorporerer vi 3D-kulturene i mikrofluidiske plater som tillater medieperfusjon under kulturen. Etter å ha vurdert de resulterende kulturene ved hjelp av en fluorescerende bildebasert levedyktighetsanalyse av rensede versus ikke-rensede celler, viser våre resultater at dette ekstra separasjonstrinnet betydelig reduserte antall ikke-levedyktige celler fra våre kulturer.

Introduction

I løpet av det siste tiåret har feltet for kreftforskning vist fornyet entusiasme for pasientavledede xenografts (PDXs) som et verktøy for å vurdere kreftcelleveiavhengighet og legemiddelfølsomhet¹. De vanligste PDX-modellene er etablert ved subkutan eller ortopisk implantasjon av menneskelige tumorceller – et tumorfragment, en klynge av dissosierte tumoravledede celler eller en prøve av isolerte sirkulerende tumorceller (CTCer) – til en gnagervert. Hvis svulsten "ta" er vellykket, vil xenograftcellene spre seg, vaskularisere og ellers samhandle med vertsvevet for å skape en svulst, som kan høstes i optimal størrelse, deles og implanteres i andre verter. Blant deres mange fordeler som modellsystem beholder PDXs vanligvis en betydelig del av den innfødte tumorcellepopulasjonens heterogenitet og muliggjør vurdering av menneskespesifikke veier^{og celleresponser 2,3}. In vivo-konteksten muliggjør tumorinteraksjon med vaskulatur og andre tilstøtende stroma og rekafulerer vevsegenskaper som stoffdiffusjonsdynamikk, oksygenspenning og ekstracellulær matrisepåvirkning som biologisk og mekanisk påvirker tumorprogresjonen. Et negativt aspekt ved PDXs er deres avhengighet av en gnagervert, både for tumorutvidelse og til slutt for hypotesetesting. Fordi mange PDX-er ikke kan tilpasse seg tradisjonell todimensjonal (2D) kultur på vevskultur polystyren uten å miste mange av sine ønskelige egenskaper, har det vært minimal middelvei for forskere mellom denne relativt kontrollerte in vitro-metoden, og den betydelige økningen i utgifter, fasiliteter og tidskrav for in vivo PDX-bruk.

Vi har beskrevet flere in vitro-modeller som implementerer 3D-cellekultur i en støttende matrise, og nylig utvidet dette arbeidet med å demonstrere ex vivo-kulturen til flere prostatakreft (PCa)-avledede PDXs, både alene og i co-kultur med benmargsavledet fibroblaster^4,,5. Hyaluronsyre (HA)-baserte vanngelmatriser gir tilpassbar og biologisk relevant støtte for begge celletyper, med facile kontroll over hydrogelegenskaper og optisk klarhet for avbildning gjennom hydrogeldybden⁶.

Modne PDX tumorvev består av en variabel blanding av heterogene humane kreftceller og mus stroma (fibroblaster, endotelceller, etc.). For å studere celle-type spesifikke bidrag til tumorprogresjon in vitro, kan det være en fordel å dissosiere svulster, skille cellepopulasjonene og eksperimentelt innlemme dem på en organisert måte for å dissekere veier for intercellulær kommunikasjon. De blandede cellepopulasjonene i vevsfordøyer har differensialkompatibilitet med spesifikke kulturforhold. For eksempel, tumor-assosiert fibroblast levedyktighet nødvendiggjør enten overflatetilslutning eller 3D matriser funksjonalisert med integrinske ligands, mens epitel-avledede PDX-celler vanligvis ikke har disse kravene, i stedet favoriserer cellecelleinteraksjoner. Disse forskjellene kan utnyttes for å oppnå effektiv separasjon av PDX-celler fra forurensende musstromale celler. Rotasjonskultur av vevsfordøyer gjør at stromal celleoverholdelse av vevskulturoverflaten mens cellecelleadhesjoner driver PDX-celler som flyter over den roterende kulturoverflaten for å danne flercellede klynger i supernatanten i 24-48 timer. De spesifikke egenskapene til disse klyngene varierer med PDX (f.eks. store, stramme, svært sfæriske klynger eller mindre, løsere aggregater som ligner bunter av druer), men er vanligvis av biologisk relevante størrelser (50-250 μm diameter), tilstrekkelig for å vurdere cellulære interaksjoner som er avhengige av intercellulære kontakter.

Tumorhenting og behandling resulterer uunngåelig i en viss grad av sikkerhet celledød, enten på grunn av kortsiktigskade fra mekanisk / enzymatisk forstyrrelse, eller langsiktig inkompatibilitet av underpopulasjoner med de valgte kulturforholdene. Til tross for nytten av rotasjonskultur som en innledende bulkseparasjon, overføres døde eller døende celler uunngåelig med PDX-klyngene og kan påvirke den resulterende kulturen. Disse døde cellene er ofte individuelle PDX-celler som ikke ble integrert i en klynge, musstrommale fibroblaster som ikke kan overleve under utvalgte kulturforhold, eller spesielt skjøre endotelceller. Slike døende celler kan påvirke eksperimentelle resultater fra "overlevende" og kan i stor grad påvirke kvantifisering, for eksempel via fluorescerende bildebaserte levedyktighetsscreeningsanalyser. For å forbedre utvalget av levende PDX-celler fra denne metoden, tilpasset vi sentrifugeringsmetoder med tetthetstrinn for enkelt å fjerne individuelle døde / døende celler fra PDX-blandinger og beholde hovedsakelig levende flercellede klynger.

For å forbedre studien av resulterende PDX-avledede klynger i 3D-kultur, vi benyttet en mikrofluidisbasert perfusjonskulturplattform, OrganoPlate (Figur 1), som er en høy gjennomstrømningsorgan-on-a-chip plattform som muliggjør samtidig kultur på opptil 96 individuelle perfused, 3D-kulturer på en 384-brønns mikrotiter platebase (figur 1A)^7,8. I 2-felts mikrofluidisk plate er en enkelt vevsbrikke forbundet med to mikrofluidiske kanaler (figur 1B, gelkanal: rød, perfusjonskanal: blå) som strekker seg over fire brønner på rad. De to mikrofluidiske kanalene er adskilt av en kort plastrygg kalt en Phaseguide som forhindrer overløp av en kanal inn i sin tilstøtende nabokanal, og samtidig gir mulighet for et membranfritt grensesnitt mellom innholdet i gelen og perfusjonskanal⁹. Fordi bunnen av mikrofluidplaten består av mikroskop-grade glass, kan kulturene ses i observasjonsvinduet gjennom bunnen av platen med et standard eller automatisert mikroskop. Perfusjon er etablert i mikrofluidisk plate med en programmerbar rocker, ved hjelp av tyngdekraften til å drive media gjennom mikrofluidiske kanaler, mellomreservoarbrønner ( figur 1C). Perfusjonsstrømmen etterligner nærmere tumormikromiljøet enn statisk kultur, noe som åpner for inkorporering av skjærstress og forbedret fordeling av gasser og næringsstoffer. Fordelene med å opprettholde en perfundert kreftcellekultur i mikrofluidisk plate har tidligere blitt beskrevet som perfused brystkreftkulturer som viste optimal levedyktighet sammenlignet med en statisk 3D-kultur av de samme cellene⁷.

Den nåværende rapporten beskriver en adapted density gradient sentrifugeringsmetode for å isolere levende flercellede PDX-klynger og demonstrerer sitt verktøy for å etablere 3D PDX-kulturer innenfor 1000 mikrofluidiske plater. Fordi et økende antall forskningslaboratorier søker metoder for å lette PDX-bruk, forventer vi at protokollene som presenteres her, vil være til umiddelbar nytte.

Protocol

Tumorvev ble innhentet med pasientens samtykke og i henhold til en godkjent Institutional Review Board (IRB) protokoll. Xenografts ble implantert, dyrket og høstet i henhold til en akseptert Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokoll.

MERK: Alt arbeid skal utføres i et sterilt biologisk sikkerhetsskap for å opprettholde steriliteten. Alle trinn bør utføres ved romtemperatur med mindre annet er spesifisert.

1. Utarbeidelse av materialer for PDX-behandling

1. Autoklaver tang og skalpell håndtak eller barberblad.
2. Tin dissosiasjonsenzymoppløsning ved 4 °C over natten eller ved romtemperatur samme dag som vevdissosiasjon.
   MERK: Tining ved 37 °C anbefales ikke, da dette kan inaktivere noen dissosiasjonsenzymer.
3. Forbered minst 100 ml PDX-kulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle medium-næringsstoffblanding F-12 [DMEM-F12] med 100 U / ml penicillin og streptomycin og 30 % føtal storfeserum [FBS]), og minst 25 ml PDX-behandlingsmedium (DMEM-F12 med 100 U/ml penicillin og streptomycin og ingen FBS). Oppbevares ved 4 °C til den er klar til bruk.

2. PDX dissosiasjon og innledende rensing av stromal komponent

1. Samle autoklaverede redskaper, 70 μm cellesiler (2-3), 60 mm runde vevskulturretter (2), 6-brønns vevskulturplater, sterile 50 ml koniske sentrifugerør og sterile 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Varm kultur medium til 37 °C og la dissosiasjon enzym løsning komme til romtemperatur.
2. Når PDX-vev har nådd en diameter på 1,0-1,5 cm i en musevert, fjerner du svulsten kirurgisk fra musen med standard midler (f.eks. under akseptert anestesi) og oppbevares på is i et 50 ml rør med PDX-kulturmedium (figur 2A). Behandle vevet raskt, via trinnene nedenfor, for å maksimere cellelevebiliteten, helst innen 1-2 timer etter høsting.
3. Overfør tumorvev til et forhåndsveid sterilt 50 ml konisk rør. Skyll 6x med 30 ml steril PBS for å fjerne blod og forurensninger. Fjern så mye væske som mulig og veie tumorvevet.
4. Overfør tumorvev til en 60 mm rund vevskulturrett og kjøttdeig i ~ 1 mm^{3 stykker} ved hjelp av et sterilt barberblad eller skalpell.
5. Tilsett 5 ml PDX-behandlingsmedium for å samle tumorslam og overføre til et nytt sterilt 50 ml rør. Skyll kulturfatet med ytterligere 5 ml PDX-behandlingsmedium, deretter med dissosiasjonsenzymoppløsning (10 ml/g svulst, minst 5 ml), og tilsett alle skyll til 50 ml-røret.
6. Inkuber 20 min ved 37 °C med skånsom risting. Virvle røret forsiktig halvveis gjennom inkubasjonstiden.
7. Pipette opp og ned forsiktig med en serologisk pipette for å bryte opp klumper. Filtrer celler med en 70 μm cellesil plassert over et nytt sterilt 50 ml rør.
   MERK: Mer enn én sil kan være nødvendig.
8. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min til pelletceller. Fjern supernatant og resuspend i 2-3 ml PDX-kulturmedium. Telle celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller.
9. Bruk tabell 1 til å estimere det nødvendige antallet dissosierte PDX-avledede celler som trengs for å oppnå ønsket celletetthet per sjetong.
   MERK: Verdiene i tabell 1 er ment å være et utgangspunkt. Faktiske verdier vil variere på grunn av vevsvariasjon/cellulæritet og celletap fra frysing/gjenoppretting. PDX svulster er individer selv innenfor en gitt krefttype, så disse verdiene bør justeres empirisk.
10. Av tallet beregnet i trinn 2,9, plate 1-2 x 10⁶ celler i 5 ml PDX kultur medium per brønn av en 6-brønns vev kultur plate. Inkuber (37 °C, 5 % CO_2,95 % fuktighet) i 48 timer med skånsom risting (50–55 o/min) for å fremme klyngedannelse (figur 2B). Etter at klyngen er dannet, fortsett til seksjon 3 for sentrifugering.
11. Kryopreserve ubrukte PDX-celler fra den første dissosiasjonen i 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimetylsulfoksid (DMSO) eller et kommersielt tilgjengelig primærcellefrysingsmedium.
    MERK: Tilhengermusstromale celler kan også gjenvinnes fra vevplateoverflaten, om ønskelig, ved å skylle kort med kulturmedium og utvide med standardmidler.
12. For senere bruk av kryopreserverte PDX tumorceller/mus stroma, tine celler i et 37 °C vannbad i 2 min. Telle og plate i en 6-brønns vev kultur plate som beskrevet i trinn 2.10 før du går videre til § 3. Øk antall PDX-celler med ~20 % for å imøtekomme levedyktighetstap fra kryopreservasjon.

3. Tetthetsgradering sentrifugeringsbasert separasjon av PDX-avledede klynger fra enkeltceller

1. Forbered 20 ml 100 % tetthetsgradientløsning ved å blande 18 ml tetthetsgradient sentrifugasjonsløsning med 2 ml steril 10x Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) i et sterilt konisk rør på 50 ml. Lag 10 ml hver på 20%, 30%, 40% og 55% tetthet gradient løsninger ved å fortynne denne 100% løsning med sterile 1x HBSS og blande godt.
   MERK: Disse volumene er tilstrekkelige for to 15 ml graderinger som kan brukes til å skille ~ 15 x 10⁶ celler hver. Hvis du skiller færre enn ~15 x 10⁶ celler, bør den andre graderingen brukes som en balanse for sentrifugering.
2. Tilsett 3 ml 55 % tetthetsgradientløsning til bunnen av et konisk rør på 15 ml. Hold røret i en vinkel, veldig forsiktig lag 3 ml 40% tetthet gradient løsning på toppen av 55% lag, sakte dispensere væsken på den vinklede siden av røret for å unngå å blande lagene. Gjenta med 30% tetthet gradient løsning.
3. Samle supernatant av PDX rotasjonskulturer med en 5 ml serologisk pipette, skylleplateoverflaten forsiktig. Sentrifuge ved 200 x g i 2 min til pelletceller.
4. Fjern supernatant og resuspend cellepellet i 3 ml av 20% tetthet gradient løsning i henhold til antall gradienter som trengs for å skille cellene. Lag forsiktig 20% tetthet gradientløsning med celler på toppen av gradienten(e). Hvis du bare bruker ett graderingsrør for celler, topper du balansegradientrøret med cellefri 20 % tetthetsgradientløsning.
5. Cap rørene og sentrifuge i en swing bøtte rotor sentrifuge i 30 min ved 4 °C, 2000 x g,og 0 brems.
6. Etter sentrifugering vil brøker være synlige (figur 2C). Samle 2−3 ml fraksjoner i friske 15 ml rør. Tilsett 3−4 volumer sterile 1x HBSS til hver brøk og inverter for å blandes grundig.
7. Sentrifuge ved 1000 x g i 3 min til pelletceller. Fjern supernatant og resuspend cellepellet i 1-2 ml PDX behandlingsmedium.
   MERK: Levedyktige PDX-celleklynger finnes vanligvis i løsningsgrensesnittet for 40–55 % tetthetsløsning (figur 2D) med én dør/døende celler som akkumuleres ved løsningsgrensesnittet for 20–40 % tetthetsgradient for de fleste PDX-er som er testet.
8. Fjern en liten, representativ aliquot (50-100 μL) for re-dissosiasjon med et likt volum av dissosiasjon enzym løsning for å vurdere cellenummer i klynget celle suspensjon. Telle celler med et hemocytometer eller automatisert celleteller.

4. Hydrogel forberedelse og mikrofluidisk plate seeding

1. Rekonstituerte HA hydrogelløsninger (tiolmodifisert HA, HA-SH; tiolreaktiv polyetylenglykoldiakrylat, PEGDA) i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Bruk en flerkanals pipette til å legge til 50 μL HBSS i alle brønner i observasjonsvinduskolonner (kolonne 3, 7, 11, 15, 19, 23) av en 2-felts mikrofluidplate for å opprettholde kulturfuktighet og optimale bildeforhold.
3. Beregn volumet av cellefjæring fra avsnitt 3 som trengs for 50 μL hydrogel ved ønsket celletetthet (det vil vil vil at 5000 celler/μL). For såing av en mikrofluidplate, aliquot det beregnede volumet i hver av 4 sterile 1,5 ml sentrifuge rør.
   MERK: HA hydrogeler har fast tid til gelering. Juster volumet av geloppløsning aliquots for brukereffektivitet ved dispensering hvis for tidlig gelering oppstår.
4. Juster pH-en til HA-SH-oppløsningen til 8.0 med 1 N NaOH umiddelbart før bruk. Utfør en testgelasjon ved å blande 40 μL HA-SH med 10 μL PEGDA og overvåke gelasjon over tid. Gelasjon begynner vanligvis 5-8 min etter blanding av HA-SH med PEGDA crosslinker.
5. Sentrifuge celle suspensjon aliquots for 2 min (200 x g, romtemperatur) til pellet celler. Fjern forsiktig de overnaturlige og gjenbrukscellene i riktig volum av HA-SH.
   MERK: Endelig hydrogel er en 4:1 HA-SH:PEGDA-oppløsning (etter volum) slik at cellene skal brukes på nytt i 40 μL ha-SH for et 50 μL endelig volum.
6. Tilsett 10 μL PEGDA til ett aliquot av celler i HA. Bland godt og vent 1−3 min (avhengig av gelasjonstid fra trinn 4.4) før du sår mikrofluidplaten.
   MERK: Slik at gelasjonsreaksjonen av start før såing bidrar til å minimere celleoppgjør.
7. Fest en spiss for dispensering av 1,5 μL volumer til en enkelt kanal som gjentar pipette og laster med celler i HA hydrogeloppløsning. Husk å holde hydrogel aliquot godt blandet for å sikre jevn cellefordeling.
8. For å så den mikrofluidiske platen, juster pipettespissen vinkelrett på platen mens du forsiktig plasserer spissen i midten av gelinntaket (kolonne 1, 5, 9, 13, 17, 21) for å sikre kontakt, men ikke noe trykk når hydrogeloppløsningen dispenseres. Arbeide raskt for å hindre for tidlig hydrogel størkning, dispensere 1,5 μL geloppløsning i hver gelinntak.
9. Ta hensyn til fyllstatusen til mikrofluidiske kanaler ved å se fra toppen av platen, bunnen av platen, eller ved mikroskop, og vurdere lasting, ved hjelp av figur 3 som en guide (vellykket lasting i figur 3A, pipet posisjonering veiledning i figur 3B, savnet lasting i figur 3C, ikke fylt for å ende i figur 3D, overløp i figur 3E). Identifiser eventuelle nødvendige justeringer i teknikk som kan forbedre fyllingssuksessen for neste runde med sjetonger (se diskusjon for feilsøkingstips).
10. Gjenta trinn 4.6−4.9 med de resterende 3 aliquots av celler i HA-løsning. Inverter platen mens du forbereder neste aliquot (~ 1 min).
    MERK: 1 min ventetid og inversjon av platen forbedrer 3D-fordelingen av cellene ved å redusere cellesettling som gelasjon oppstår.
11. Etter at alle sjetongene er fylt, inkuber platen ved 37 °C i en fuktet inkubator til geleringen er fullført (~45 min).
12. Bruk den medfølgende håndboken til å sørge for at perfusjonsrockeren er installert i cellekulturinkubatoren med riktige perfusjonsinnstillinger (14° vinkel, 4 min intervaller).
13. Tilsett 50 μL PDX-kulturmedium til alle mellomstore viker (kolonne 2, 6, 10, 14, 18, 22) og kontroller om kanalene fylles riktig ved å vende platen. Bank platen forsiktig mot en overflate for å oppmuntre væsken til å fylle mikrofluidiske kanaler.
14. Tilsett 50 μL DMEM-F12 (10% FBS) for alle mellomstore utsalgssteder (kolonne 4, 8, 12, 16, 20, 24). Hvis noen luftbobler er fanget i perfusjonskanalen, fjern ved å forsiktig trykke platen mot en overflate.
15. Ved hjelp av et mikroskop og platelayoutskjema (Supplerende figur 1) registrerer du suksess for fylling av chip. Ekskluder feil fylte sjetonger fra videre eksperimentell bruk.
16. Plasser platen på en vippende vippesett til en 14° vippe og en 4 min syklus for å begynne perfusjon. Bytt ut PDX-kulturmedium annenhver dag (første 50 μL i innløp og deretter 50 μL i utløp).

5. Cellefarging, bildebehandling og bildekvantifisering

1. Forbered en celle levedyktighet analyseløsning som inneholder tre fluorescerende fargestoffer (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. Forbered lagerløsninger av hvert fargestoff som følger: Hoechst 33342 ved 1,6 mM (1 mg/ml) i deionisert vann; calcein AM ved 4 mM i vannfri DMSO; ethidium homodimer-1 ved 2 mM i DMSO / H₂O (1:4, v / v).
      MERK: Lagerkalcein AM og ethidium homodimer-1-løsninger er gitt i det kjente settet i Materials tabell.
   2. Forbered en enkelt arbeidsløsning i HBSS eller fenolrødt medium, som inneholder alle tre fargestoffer. Optimaliser endelig arbeidskonsentrasjon for hver celletype og matrise, innenfor områdene 1,6-8,0 μM for Hoechst 33342, 0,1−10 μM for calcein AM og 0,1−10 μM for ethidium homodimer-1.
2. Fjern kulturmedium og bruk arbeidsflettelsesfargeløsningen på ønskede mikrofluidiske chips (75 μL i innløp, 25 μL i utløpet) og plasser tilbake på perfusjonsrockeren i cellekulturinkubatoren i 1 time.
3. Bilde observasjonsvinduene i de beisede kulturene ved hjelp av et manuelt eller automatisert konfokalt mikroskop (Materialsekk) med fluorescerende filtre (oppført som eksitasjons-/utslippsbølgelengder, i nm) for å observere alle kjerner (Hoechst 33342, 350/461), døde cellekjerner (ethidium homodimer-1, 528/617), og levende celle cytoplasma (calcein AM, 494/517).
4. Ta 140 μm Z-stabler med en trinnstørrelse på ≤ 1 μm ved hjelp av et 20x luftmål. Tre synsfelt er nødvendig for å se hele mikrokanal med en liten mengde overlapping. For å unngå dobbelt prøvetaking, bilde bare to synsfelt per sjetong.
   MERK: Bildeforholdene bør optimaliseres for å sikre riktig NyQuist-prøvetaking. I forfatternes erfaring er et raskt bildesystem, basert enten på overføring av en konvensjonell epi-fluorescenskilde eller resonansskanningsmodus på en konfokal, nødvendig for å fullt ut analysere en komplett Z-stabel, med tre laserfarger, over 96 chips på en tallerken innen rimelig tid (omtrent 3,5 timer med automatisert bildebehandling, inkludert oppsett).
5. Ved hjelp av bildeanalyseprogramvare, analyser Z-stakkbildene for de ønskede kvantifiserte dataene, for eksempel morfologi, aggregeringstilstand eller andre funksjoner. For å kvantifisere celle levedyktighet, telle antall døde celler (rød) og totale cellekjerner (blå).

Representative Results

En programmerbar perfusjonsrocker ble utarbeidet i en standard vann-jacked celle kultur inkubator, og to-lane mikrofluidiske plater ble utarbeidet i en standard biosikkerhet skap for lasting (Figur 1). En MDA-PCA-118b PDX svulst ble utvidet in vivo, høstet når den hadde nådd en maksimal størrelse, og dissosiert som beskrevet i protokoll seksjon 2 for å skape en slurry suspensjon av celler, med omtrent en enkeltcellet tilstand (Figur 2A). Slammet ble dispensert i 6-brønns vevskulturplater, og plassert på en XY rotator som beskrevet, i 48 timer. Mus stroma festet til bunnen av vev kultur plate, som tidligere har blitt beskrevet, og de menneskelige PDX cellene forble flytende i mediet, montert i klynger (Figur 2B). Demonterte enkeltceller var også synlige gjennom hele løsningen.

En trinntetthetsgradient ble etablert i et sentrifugerør ved hjelp av metodene i protokollseksjon 3. Den overnaturlige suspensjonen av PDX-celler ble aspirert forsiktig fra multivelplaten, lastet på trinngradienten og sentrifugert som beskrevet. Etter sentrifugering var et uklart bånd, som inneholdt PDX-klyngene, synlig i nærheten av grensesnittet mellom brøker 2 og 3, og enkeltceller ble identifisert i grensesnittet mellom brøker 1 og 2 (figur 2D). Fraksjoner ble samlet inn som beskrevet, fortynnet ytterligere i HBSS, og sentrifugert igjen for å fjerne tetthetsgradientløsningen. Den supernatante ble aspirert, og de resulterende cellepellets ble gjenbrukt i PDX behandlingsmedium. Et lite aliquot av hver bearbeidet brøk ble vurdert av mikroskop, for å bekrefte at den forventede fraksjonen inneholdt PDX-klynge, og at den separate fraksjonen inneholdt primært enkeltceller.

HAs hydrogelløsninger ble rekonstituert som beskrevet i protokoll avsnitt 4, og PDX-klynger ble gjenbrukt i hydrogelløsningen. PDX-løsninger ble lastet inn i chips på mikrofluidplaten og vurdert for vellykket lasting (figur 3). I de fleste tilfeller ble > 90% av sjetongene lastet vellykket etter litt praksis med teknikk og justering av lastevolumer. Etter lasting av ønsket antall chips, og inkubering for gelasjon som beskrevet, ble PDX kulturmedium lagt til mikrofluidplaten, og platen ble dyrket med perfusjon.

Ved hjelp av fluorescerende fargestoffer og metodene i protokollseksjon 5, og konfokal mikroskopi, ble 3D mikrofluidisk PDX-kultur levedyktighet og morfologi evaluert i både uforberedte og tetthet gradient sentrifugasjon separerte forhold (figur 4A). Bilder av disse platene ble registrert som Z-stabler på det konokale mikroskopet og vurdert for celle levedyktighet i bildeanalyseprogramvare. På dag 1 viste de kulturene som gjennomgikk separasjonsmetoden 10 ganger færre enslige, døde celler (rød), sammenlignet med uforberedte kulturer (figur 4B). Viktigere, de separerte klyngene besto hovedsakelig av levende celler (grønn). Ingen statistisk signifikant forskjell ble identifisert for klyngestørrelsesfordelingen (figur 4C).

Kulturer ble videre opprettholdt i mikrofluidisk plate i syv dager (figur 5A). Prøvene ble vurdert med jevne mellomrom ved hjelp av de samme bilde- og kvantifiseringsmetodene som ovenfor. Det totale antallet levende celler forble konsistent (figur 5B) og klynger beholdt ~ 80% levedyktighet (Figur 5C) over kulturens levetid. Celletettheten i den uforlignede tilstanden er omtrent en tredjedel av den separerte tilstanden fordi enkeltceller lever under celletelling, men dør raskt i hydrogelen. Det er også mer variasjon i klyngestørrelse uten tetthetsgradientseparasjon.

Figur 1: Den 2-felts perfusable mikrofluidiske platen. (A)Den 2-felts mikrofluidiske platen er en standard 384-brønns mikrotiterplate med modifisert bunn bestående av mikrofluidiske kanaler innebygd mellom glassplater. Hver plate består av 96 vevschips for 3D-cellekultur. (B)Sett fra toppen av platen, består en enkelt 2-felts mikrofluidisk chip av 4 brønner på rad forbundet med gelkanalen (rød) og perfusjonskanal (blå); gelinntaket, perfusjonsinntaket, observasjonsvinduet og perfusjonsuttaket. (C) Perfusjon oppnås i mikrofluidplate med en programmerbar rocker som bruker tyngdekraften til å drive media mellom perfusjonsinntak og utløpsbrønner som er mediereservoarer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: ISOLASJON AV PDX-klynger. (A)Disseker primær PDX vev og dissosiere i en enkelt celle suspensjon som inneholder både menneskelige PCa celler og mus tumor stroma. Enten cryopreserve dissosiert celle blanding eller (B) legge til rotasjon kultur for å rydde tumorceller og la musen stromal celler å holde seg til vev kultur plate (48 h). (C) Bruk tetthet gradient sentrifugasjon for å fjerne gjenværende døde enkeltceller, og (D) samle levedyktige PDX klynger på grensesnittet mellom tetthet gradient lag 40% og 55% (rød stiplet boks). (E) Gjenopprett PDX-klynger, gjenoppliv i hydrogelforløperløsning, og dispenser på platen med en gjentatt pipette. (F) Eksempelberegninger, tilsvarende tabell 1,viser de nødvendige innledende cellenumrene som kreves for å nå en endelig ønsket cellekonsentrasjon for alle sjetonger over en plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Overvåking av mikrofluidplatelasting. Laster suksess og feil, kan vurderes av øye (i topp og bunn visninger), med bekreftelse av mikroskop. (A) Vellykket lasting identifiseres av en åpen (lys) perfusjonsfelt i topp- og bunnvisning, og en litt mørkere gelbane i nederste visning. Visualisering av mikroskop bekrefter at gelbanen var fylt helt med celler og gelforløper, uten å søle over i det tilstøtende kjørefeltet. (B) Cartoon viser riktig pipet tips plassering under gel dispensering, med riktig plassering er like over innløpsporten (venstre) og feil plassering blir off-sentrert (midten) eller bruke kraft på innløpsporten (høyre). (C) Lyse baner i alle visninger indikerer en savnet belastning, noe som tyder på at pipetspissen ikke var riktig plassert i gelinntaket. (D) En delvis fylling av gelbanen (ikke fylt til ende) identifiseres av den røde pilen, som viser hvor den fremadstormende gelløsningsfronten ble avbrutt, enten av en fanget luftboble eller en for tidlig pause i lasting. Den røde pilen i mikroskopvisningen identifiserer samme plassering. (E) Innholdet i gelbanen fløt over PhaseGuide, sølte inn i perfusjonsfeltet og til slutt blokkerte den. Denne overløp er synlig i bunnen av det mørke utseendet på både gel og perfusjonsbaner. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Cellefarging og levedyktighetsvurdering i mikrofluidplate. (A)Ved hjelp av fluorescerende flekker ble levedyktighet vurdert i uforlignelige og separerte PCa-celleklynger seeded i mikrofluidplate (alle kjerner: Hoechst 33342, blå; døde celler: ethidium homodimer-1, rød; og levende celler: calcein AM, grønn). Skalalinje = 50 μm. (B) Totalt antall døde celler ble kvelt på dag 1 av kulturen og separertE MDA-PCa-118b PDX-kulturer viste en betydelig reduksjon i antall døde celler. (C) Kvantifisering av klyngestørrelse for PCa PDXs, i separerte og uforlignelige kulturer, viste en liten økning, men ingen statistisk signifikant forskjell. Stolper og feilfelt i panel B representerer gjennomsnittet og standardavviket på 4 bilder per betingelse (2 sjetonger med 2 bilder/brikke). Stjerne (*) representerer statistisk signifikante forskjeller (p < 0,05) sammenlignet med den uforlignede tilstanden ved hjelp av en elevs t-test. For boksen og whisker plottet i panel C, angir kryssikonet gjennomsnittet, og den horisontale linjen representerer medianen, på 4 bilder per betingelse (2 sjetonger med 2 bilde / chip). Boksen inneholder 50% av dataene mens whiskers strekker seg til minimum og maksimal klyngediameter for hver betingelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Karakterisering av separert MDA-PCa-118b i mikrofluidplaten. (A)Separert (venstre) og uforberedt (høyre) PCa kreftcelleklynger ble seeded i mikrofluidisk plate og perfundert i opptil syv dager. Kulturer ble farget med tre fargestoffer spesifikke for alle kjerner (Hoechst 33342, blå), døde celler (ethidium homodimer-1, rød), og levende celler (calcein AM, grønn). Skalalinje = 50 μm. (B,C) Mengde av antall celler og kultur levedyktighet fra bilder over en uke med kultur med en såetetthet på 8000 celler / μL. Barer og feilfelt representerer gjennomsnittet og standardavviket for fire bilder per tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Endelig ønsket celletetthet i enkeltbrikke (celler/μL)	Volum lastet per spon (μL)	Antall spon på mikrofluidplate	Mutiplier for ekstra volum	Figur 2C: Antall separerte celler som kreves for en full mikrobrønnplate (trinn 3.8)	Multiplikator for celletap (stromafjerning, celledød)	Figur 2B: Starter # av dissosierte PDX-celler for protokoll (trinn 2.8)
2,500	1.5	96	1.3	4.7E+05	3	1.4E+06
5,000	1.5	96	1.3	9.4E+05	3	2.8E+06
10,000	1.5	96	1.3	1.9E+06	3	5.7E+06
20,000	1.5	96	1.3	3.7E+06	3	1.1E+07

Tabell 1: Omtrentlig innledende og endelig PDX-materiale som kreves for å laste inn en enkelt 2-felts mikrofluidplate.

Tilleggsfigur 1: Den 2-felts mikrofluidiske plateoppsettet. Etter såing av mikrofluidisk plate, registrere individuell chip lasting suksess (vellykket, savnet lasting, ikke fylt til slutt, eller overløp) ved hjelp av 2-lane plate layout. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Her beskriver vi en metode for behandling og dyrking av levedyktige PDX-avledede tumorceller i et høyt gjennomstrømmings-, perfundert 3D-kultursystem. Mens denne protokollen benytter PCa PDX vev, det er like effektivt for andre epitel-avledede svulster. Tumoregenskaper varierer mellom individuelle PDX-linjer selv innenfor samme opprinnelsesvev (prostata, bryst, etc.). Noen PCa PDX linjer er mer fibrotiske og vanskelig å isolere levedyktige celler fra mens andre er mer cellulære. Tumorstørrelsen som er nevnt her, kan varieres innenfor IACUC-retningslinjene for å gi mer vev for spesielt lavutbyttesvulster. I tillegg kan tumorfragmenter samles etter trinn 2.7, fordøyes på nytt og sammen med den første fordøyelsen for å øke utbyttet. Dette er spesielt nyttig for mer ekstracellulære matrisetunge svulster. Ytterligere runder med fordøyelsen forbi to resulterer vanligvis i lav levedyktighet og lavt utbytte og anbefales ikke.

Rensingen av PDX-avledede populasjoner, for å fjerne døde / døende celler eller forurensende vertsceller, er gunstig for den utvidede 3D-kulturen og kvantifiseringen av de ønskede kreftcellene. Det første trinnet i rensingen som er beskrevet her – suspensjonskultur i et relativt stort volum av medier sammen med XY-rotasjon ved moderate hastigheter – fremmer 1) selektiv ekstraksjon av svært vedheftsavhengige celler, vanligvis musstrommale fibroblaster og 2) dannelsen av celleaggregater for å levere pro-survival cellecellekontakt. Effektiviteten av å trekke ut vertsavledede musefibroblaster under 48 h XY rotasjonstrinnet er svært høy, som beskrevet i Fong et al.⁵. Tilsiktet PCa-fibroblast co-kulturer er absolutt mulig, som vi har demonstrert, men krever en innstilt matrise (for å støtte fibroblast vedheft til matrise) og en større andel av fibroblaster. Sporadisk PDX, vanligvis de med mer mesenchymale egenskaper, vil holde seg lettere til vevskulturflater under 48-timers rotasjonskulturtrinn. PDX-linjer bør overvåkes nøye første gang denne protokollen utføres, og immunostained for HNA, for å identifisere andelen menneskelige celler i de tilklutnende og ikke-tilhengerpopulasjonene. Ikke-vev kultur behandlede plater bør brukes til klyngedannelse med disse PDXs. Mus stromal celler vil fortsatt holde seg til slutt til overflaten, men separasjon vil ikke være så effektiv.

Etter rotasjonskulturen behandles den overnaturlige som inneholder den ikke-tilhengerte befolkningen gjennom den beskrevne tetthetsgradiententrigeringsmetoden. Protokollen som rapporteres her, kan forenkles for å utelate minst ett tetthetstrinn (f.eks. ved hjelp av bare 20%, 40% og 55% løsninger), men alle fire bør brukes når de etablerer denne metoden med hver nye PDX. Flercellede klynger skilles enkelt fra individuelle celler ved denne metoden, og beholder i stor grad sin grupperte fenotype og andre egenskaper. Den kasserte encellede populasjonen representerer enten (a) celler som var døde /døende før rotasjonstrinnet på 48 timer, og dermed aldri integrert i en klynge, eller (b) celler som forble i live etter 48 h rotasjon, men fortsatt ikke integreres i klynger. Det er viktig å merke seg at gruppe (b) kan inkludere celler som noen etterforskere finner ønskelig; f.eks, noen rapporter har beskrevet primære cellekulturer som inneholder tidlige stamceller / stamceller, eller resistente celler, som flyter innenfor supernatant som dårlig tilhenger enkeltceller over en ellers^{tilhengerbefolkning 10}. Relevant for kreftstudier, sirkulerende tumorceller (CTCer), tumorinitierende celler (TICer) eller andre lignende metastasefremmende celletyper kan være en del av denne enkeltcellepopulasjonen. Derfor bør etterforskere som bruker vår protokoll analysere nøye den kasserte enkeltcellepopulasjonen for å sikre at noen celler av interesse ikke har gått tapt. I våre hender er de aller fleste av disse enkeltcellene enten en liten brøkdel av kreftceller som er døde / døende på grunn av den første vevdissosiasjonsprotokollen, eller gnagerfibroblaster som allerede går gjennom anoikis.

Det anbefales sterkt å praktisere teknikken for å så mikrofluidisk plate med mindre dyrebare celler for å sikre suksess når du arbeider med begrenset og verdifullt PDX-materiale. Vær oppmerksom på tippplassering under dispensering, da feil teknikk sannsynligvis vil resultere i 1) overløp hvis trykket påføres under lasting, eller 2) tomme eller delvis fylte kanaler hvis spissen ikke er sentrert over innløpsporten. For tidlig gelasjon vil også føre til at kanaler ikke fylles til slutten. Hvis dette skjer, redusere ventetiden mellom tilsetning av PEGDA crosslinker og dispensere gel løsning, eller arbeide med mindre aliquots av gel løsning om gangen. Dispenseringsvolumene som brukes i denne protokollen er godt optimalisert for suksess med HA hydrogeler. Bruk av mer viskøse løsninger som Matrigel i dette systemet krever en økning i dispenseringsvolumet til ~ 2 μL for riktig fylling av mikrofluidiske kanaler. Legg også merke til at valget av 50 μL trinn i trinn 4.3, utarbeidelse av fire celle pellets i samme trinn, og gjenta resuspensjoner i trinn 4.10 er bevisst; selv om de gir mer materiale enn nødvendig, gir de også overskjening for å ta høyde for tap fra den gjentatte pipetten.

Det bør bemerkes at hver PDX sannsynligvis vil ha en unik morfologi og størrelsesfordeling innenfor denne 3D-kulturmodellen. På en måte forventes dette, på grunn av mangfoldet av pasientsykdom, vevshistorie, matriseparametere og mange andre faktorer. En ekspansiv vurdering av flere prostatakreftlinjer i Matrigel viste dette potensielle mangfoldet¹¹. Likevel kan etterforskerne bli overrasket over å finne en stor variasjon i de ovennevnte parametrene. I et manuskript som forberedelse presenterer vi et bredt blikk på flere PDX-er på denne kulturplattformen; cellene opprettholder en konsekvent respons innenfor hver PDX-type, men kan variere vesentlig på tvers av prøver, noe som resulterer i klynger som for eksempel er store med høy celletetthet per klynge, eller mindre, med løsere intercellulære tilkoblinger. Den spesifikke oppførselen til hver PDX bør vurderes av undersøkere over flere studier, for å bekrefte en forutsigbar og karakteristisk morfologi. Undersøkere kan forvente at prøver følger den generelle atferden som er beskrevet i dette papiret.

Oppsummert gir den presenterte protokollen forskere en ny metode for å ansette PDXs ex vivo i en plattform som muliggjør finjustering av kulturforhold og inkorporering av relevante 3D-miljøsignaler som vevsspesifikk ekstracellulær matrise (ECM) og perfusjonsflyt, slik at utvidet celleoverlevelse over flere dager eller uker. Detaljert karakterisering av disse kulturene ble oppnådd ved farging og morfologiske analyser demonstrert her. I tillegg, om nødvendig, kan kulturer sendes til plateleserbaserte analyser, immunofluorescent merking, eller brukes til fremstilling av lysater som muliggjør ytterligere molekylær karakterisering. Selv om vi tidligere har publisert noen elementer av PDX 3D-kultur innen hydrogeler, er denne anvendelsen av flertrinnsrensing ny, enkel å ansette i et standardlaboratorium og vellykket i å beholde høy levedyktighet representative kulturer. OrganoPlate-plattformen, i sine 2-felts og 3-felts varianter, gir ytterligere kompleksitet gjennom sin modell av vevperfusjon, og en viktig mulighet til å bruke enda færre celler per eksperiment. Sammenlignet med våre tidligere modeller reduserte den mikrofluidiske plattformen cellekravene med en faktor på ~ 30, per eksperiment, noe som er en enorm fordel, gitt den knappe tilgjengeligheten av PDX-tumorvev i de fleste laboratorier. Det mikrofluidiske systemet muliggjør utvidet bildebehandling, immunstaining og facile imaging, på tvers av en cellepopulasjon som er stor nok (n = ~ 2000−4000 celler per bildevindu) for å tillate kvantifisering av fenotype i sammenheng med romlig organisasjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable