細菌群のタイムラプスイメージングと集団ストレス応答
Summary
我々は、平板文書スキャナを用いて、バクテリオファージ(ファージ)および抗生物質ストレスに反応する緑膿菌群の高解像度タイムラプスムービーを生成する簡単な方法を詳述する。この手順は、群れの動態を監視するための迅速かつ簡単な方法であり、他の細菌種の運動性および成長を研究するために適応され得る。
Abstract
群れは、緑膿菌や大腸菌を含む多くの細菌種で観察される表面運動性の一形態である。ここでは、細菌の密集した集団は、数時間にわたって特徴的な傾向性の形をしたコミュニティで大きな距離を移動します。群れは、中程度の水分、湿度、栄養素の含有量を含むいくつかの要因に敏感です。さらに、抗生物質やバクテリオファージ(ファージ)によってストレスを受けるP.緑内症で観察される集団ストレス応答は、ストレスを含む領域に近づくから群れを撃退する。ここで説明する方法は、群れの影響を及ぼす重要な要因を制御する方法を説明します。フラットベッド文書スキャナを用いて、群れの動態や高い時間分解能での集合的ストレス応答を監視する簡単な手法を紹介し、群れの定量分析を行う方法を説明する。このシンプルで費用対効果の高い方法は、群れの正確かつ適切に制御された定量を提供し、他のタイプのプレートベースの成長アッセイおよび細菌種に拡張することができます。
Introduction
群れは、抗生物質耐性を増加させ,、宿主1、2、32における病原性因子の産生を増加させる協調1細菌運動性の集合的形態である。3この多細胞挙動は、肺,4,5の上皮膜を覆う粘膜層に似た半固体表面で起こる。4バイオサーファクタントは、表面の表面張力を克服するために群れの集団によって一般的に生産され、これらの産生は、クォーラム,センシング6、7、87としても知られている複雑な6細胞シグナル伝達システムによって調節される。8緑膿菌、黄色ブドウ球,菌、大腸菌9、10、11、12,10など、多くの種の細菌が群がることができる。11,12細菌によって作成される群れのパターンは多様であり、栄養成分、気孔率、および水分13、14を含む表層の物理的および化学的特性の影響を14受ける。表面特性に加えて、成長温度と周囲湿度は、群れの速度とパターン12、13、14、15,13,14を含む群れのダイナミクスのいくつかの側面に影響を与えます。群れに影響を与える成長変数は、実験再現性と結果を解釈する能力に影響を与える課題を作成します。ここでは、タイムラプスイメージングを通じて細菌群の動態をモニタリングする簡単な標準化方法について述べていきます。この方法では、群れの進行に大きな影響を与える重大な成長条件を制御する方法について説明します。従来の群れの分析方法と比較して、このタイムラプスイメージング法により、長期間にわたって高解像度で複数の群れの運動性を同時に追跡することができます。これらの側面は、群れを監視することで得られるデータの深さを改善し、群れに影響を与える要因の識別を容易にします。
P.緑素吸塩の群れは、周囲の領域6,6、16にラムノリプト脂質および3-(3-ヒドロキシアルカノキシ)アルカノ酸の生産および放出を通じて促進される。抗生物質の亜致死濃度またはファージウイルスによる感染からのストレスの導入は、群れの組織に影響を与える。特に、これらのストレスは、P.エルギノーサがクォーラムセンシング分子2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロンを放出することを誘導し、シュードモナスキノロンシグナル(PQS)17,18とも呼ばれる。17,18群れの2つの集団を含む群れのアッセイでは、ストレス誘発集団によって産生されるPQSは、ストレスを含む領域に入って未処理の群れを撃退する(図1)。この集団ストレス応答は、近くの脅威18、19についてP.緑内鼻波に警告する危険な通信信号システムを19構成する。P.緑素吸い、集団ストレス応答の活性化、および群れの反発に対するストレスの影響は、ここで説明するタイムラプスイメージング法を用いて可視化することができる。ここで説明するプロトコルは、(1)群れのための寒天プレートを準備する方法、(2)2種類のアッセイ(伝統的な群れのアッセイまたは集団ストレス応答アッセイ)のための培養P.エルギノーサ(図1)、(図1)タイムラプス画像の取得、および(4)ImageJを使用して画像をコンパイルして分析する方法を説明しています。
簡単に言えば、一晩培養したP.緑頭症は群がる寒天プレートの真ん中に見られ、ファージに感染したり抗生物質で治療したP.緑素吸い目は衛星位置で発見される。P.緑素吸い込みの進行は、湿度調節された37°Cインキュベーターに置かれた消費者文書フラットベッドスキャナーで監視されます。スキャナーは、群れの成長期間(通常は16〜20時間)にわたって定期的にプレートを自動的にスキャンするソフトウェアによって制御されます。この方法は6つの10 cmの群れの版の同時タイムラプスビデオを得る。画像は映画にコンパイルされ、ストレス誘発集団による群れの反発は、自由に利用できるImageJソフトウェアを使用して定量化される。異なる群れの実験間の一貫性と再現性を確保するために、特別な配慮がなされている。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、群れの寒天プレートの変動を最小限に抑え、P.緑素吸砂のタイムラプス画像を取得し、ストレスに応答するための簡単で低コストの方法を提供することに焦点を当てています。この手順は、培地組成および増殖条件を適応させることによって、他の細菌系を画像化するように拡張することができる。P.緑素吸塩の場合、M9またはFABの最小培地は群生<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B.、A.S.、およびN.M.H-K.原稿を書き、改訂した。すべての著者は実験を設計しました。J.-L.B.は実験と分析を行った。この作品は、NIH賞K22AI112816とR21AI139968助成金によって支えられ、A.S.とカリフォルニア大学によって支えられました。N.M.H-K.ルンドベック・フェローシップR220-2016-860およびR251-2017-1070によって支えられた。資金提供者は、出版のために作品を提出する決定に何の役割も持っていませんでした。私たちは宣言する競合する利益を持っていません。
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
Referências
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