Imagem de lapso de tempo de enxames bacterianos e a resposta ao estresse coletivo
Summary
Detalhamos um método simples para produzir filmes de lapso de tempo de alta resolução de enxames pseudomonas aeruginosa que respondem a bacteriófagos (phage) e estresse antibiótico usando um scanner de documentos de leito. Este procedimento é um método rápido e simples de monitoramento da dinâmica do enxame e pode ser adaptado para estudar a motilidade e o crescimento de outras espécies bacterianas.
Abstract
Swarming é uma forma de motilidade superficial observada em muitas espécies bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli. Aqui, populações densas de bactérias se movem por grandes distâncias em comunidades características em forma de tendril ao longo das horas. O enxame é sensível a vários fatores, incluindo umidade média, umidade e teor de nutrientes. Além disso, a resposta ao estresse coletivo, observada em P. aeruginosa que são estressadas por antibióticos ou bacteriófagos (phage), repele enxames de aproximação da área que contém o estresse. Os métodos descritos aqui abordam como controlar os fatores críticos que afetam o enxame. Introduzimos um método simples para monitorar a dinâmica do enxame e a resposta ao estresse coletivo com alta resolução temporal usando um scanner de documentos de leito, e descrevemos como compilar e realizar uma análise quantitativa de enxames. Este método simples e econômico fornece quantificação precisa e bem controlada do enxame e pode ser estendido a outros tipos de ensaios de crescimento baseados em placas e espécies bacterianas.
Introduction
Swarming é uma forma coletiva de motilidade bacteriana coordenada que aumenta a resistência a antibióticos e a produção de fatores de virulência no hospedeiro1,2,3. Esse comportamento multicelular ocorre em superfícies semi-sólidas que se assemelham às das camadas mucosas que cobrem membranas epiteliais nos pulmões4,5. Os biosurfactantes são comumente produzidos por populações de enxame para superar a tensão superficial nas superfícies e a produção destes é regulada por sistemas complexos de sinalização celular-célula, também conhecidos como detecção de quórum6,7,8. Muitas espécies de bactérias são capazes de enxame, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Escherichia coli9,10,11,12. Os padrões de enxame criados pelas bactérias são diversos e são afetados pelas propriedades físicas e químicas da camada superficial, incluindo composição de nutrientes, porosidade e umidade13,14. Além das propriedades superficiais, a temperatura de crescimento e a umidade ambiente afetam vários aspectos da dinâmica do enxame, incluindo a taxa de enxame e os padrões12,,13,,14,15. As variáveis de crescimento que afetam o enxame criam desafios que impactam a reprodutibilidade experimental e a capacidade de interpretar resultados. Aqui, descrevemos um método padronizado simples para monitorar a dinâmica dos enxames bacterianos através de imagens de lapso de tempo. O método descreve como controlar condições críticas de crescimento que afetam significativamente a progressão do enxame. Comparado com os métodos tradicionais de análise de enxames, este método de imagem de lapso de tempo permite rastrear a motilidade de múltiplos enxames simultaneamente durante longos períodos de tempo e com alta resolução. Esses aspectos melhoram a profundidade dos dados que podem ser obtidos a partir do monitoramento de enxames e facilitam a identificação de fatores que afetam o enxame.
O enxame em P. aeruginosa é facilitado através da produção e liberação de rhamnolipids e ácidos alcalinoicos 3-(3-hidroxialnoyloxy)na área circundante6,16. A introdução de estresse a partir de concentrações subletais de antibióticos ou infecção pelo vírus phage impacta a organização de enxames. Em particular, essas tensões induzem p. aeruginosa a liberar a molécula de detecção de quórum 2-heptyl-3-hidroxi-4-quinolone, também conhecida como sinal de quinolone pseudomonas (PQS)17,18. Em ensaios de enxame que contêm duas populações de enxames, o PQS produzido pela população induzida pelo estresse repele enxames não tratados de entrar na área que contém o estresse (Figura 1). Esta resposta coletiva de estresse constitui um sistema de sinalização de comunicação de perigo que alerta P. aeruginosa sobre ameaças próximas18,19. Os efeitos do estresse em P. aeruginosa,a ativação da resposta ao estresse coletivo e a repulsa dos enxames podem ser visualizados usando o método de imagem de lapso de tempo descrito aqui. O protocolo descrito aqui explica como: (1) preparar placas de ágar para enxame, (2) cultura P. aeruginosa para dois tipos de ensaios (ensaios tradicionais de enxame ou ensaios de resposta ao estresse coletivo) (Figura 1), (3) adquirir imagens de lapso de tempo, e (4) usar ImageJ para compilar e analisar as imagens.
Resumidamente, P. aeruginosa de uma cultura noturna é vista no meio de uma placa de ágar, enquanto P. aeruginosa que são infectados com phage ou tratados com antibióticos são vistos nas posições do satélite. A progressão do enxame de P. aeruginosa é monitorada em um scanner de fundo de documento de consumo que é colocado em uma incubadora de 37 °C regulada pela umidade. O scanner é controlado por um software que verifica automaticamente as placas em intervalos regulares durante o período de crescimento do enxame, tipicamente de 16 a 20 h. Este método produz vídeos de lapso de tempo simultâneos de até seis placas de enxame de 10 cm. As imagens são compiladas em filmes e a repulsa de enxames por populações induzidas pelo estresse é quantificada usando o software ImageJ livremente disponível. Considerações especiais são dadas para garantir consistência e reprodutibilidade entre diferentes experimentos de enxame.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se concentra em minimizar a variabilidade no enxame de placas de ágar e fornecer um método simples e de baixo custo para adquirir imagens de lapso de tempo de P. aeruginosa e responder ao estresse. Este procedimento pode ser estendido à imagem de outros sistemas bacterianos, adaptando a composição da mídia e as condições de crescimento. Para P. aeruginosa,embora m9 ou fab médio mínimo possa ser usado para induzir o enxame16,21…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., e N.M.H-K. escreveu e revisou o manuscrito. Todos os autores projetaram os experimentos. J.-L.B. realizou os experimentos e análises. Este trabalho foi apoiado pelo prêmio NIH K22AI112816 e R21AI139968 bolsa para a A.S. e pela Universidade da Califórnia. N.M.H-K. foi apoiado pela Lundbeck Fellowships R220-2016-860 e R251-2017-1070. Os financiadores não tiveram papel na decisão de submeter o trabalho à publicação. Não temos interesses concorrentes para declarar.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
Referências
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