Time-lapse Imaging af bakterielle sværme og den kollektive stress respons
Summary
Vi beskriver en simpel metode til at producere høj opløsning time-lapse film af Pseudomonas aeruginosa sværme, der reagerer på bakteriofage (fag) og antibiotika stress ved hjælp af en flatbed dokument scanner. Denne procedure er en hurtig og enkel metode til overvågning af sværmer dynamik og kan tilpasses til at studere motilitet og vækst af andre bakteriearter.
Abstract
Sværmer er en form for overflade motilitet observeret i mange bakteriearter, herunder Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli. Her, tætte populationer af bakterier bevæge sig over store afstande i karakteristiske tendril-formede samfund i løbet af timer. Sværmer er følsom over for flere faktorer, herunder medium fugt, fugtighed, og næringsstofindhold. Hertil kommer, at den kollektive stress respons, som er observeret i P. aeruginosa, der er stresset af antibiotika eller bakteriofage (fag), frastøder sværme fra nærmer sig det område, der indeholder stress. De metoder, der er beskrevet her, omhandler, hvordan du styrer de kritiske faktorer, der påvirker sværmer. Vi introducerer en enkel metode til at overvåge sværmer dynamik og den kollektive stress respons med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af en flatbed dokument scanner, og beskrive, hvordan man kompilere og udføre en kvantitativ analyse af sværme. Denne enkle og omkostningseffektive metode giver præcis og velkontrolleret kvantificering af sværmning og kan udvides til andre typer pladebaserede vækstanalyser og bakteriearter.
Introduction
Sværmning er en kollektiv form for koordineret bakteriel motilitet , der øger antibiotikaresistens og produktion af virulensfaktorer i værten1,2,3. Denne flercellede adfærd opstår på halvfaste overflader, der ligner dem af slimhinder, der dækker epitelmembraner i lungerne4,5. Biosurfactants er almindeligt produceret af sværmer populationer til at overvinde overfladen spændinger på overflader og produktionen af disse er reguleret af komplekse celle-celle signalsystemer, også kendt som kvorum sensing6,7,8. Mange arter af bakterier er i stand til sværmer, herunder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, og Escherichia coli9,10,11,12. De sværmer mønstre skabt af bakterier er forskellige og påvirkes af de fysiske og kemiske egenskaber af overfladen lag, herunder næringsstof sammensætning, porøsitet, og fugt13,14. Ud over overfladeegenskaber påvirker væksttemperatur og luftfugtighed flere aspekter af sværmerdynamik, herunder sværdehastighed og mønstre12,13,14,15. De vækstvariabler, der påvirker sværmer, skaber udfordringer, der påvirker eksperimentel reproducerbarhed og evnen til at fortolke resultater. Her beskriver vi en simpel standardiseret metode til at overvåge dynamikken i bakterielsværme gennem time-lapse imaging. Metoden beskriver, hvordan man styrer kritiske vækstbetingelser, der i væsentlig grad påvirker udviklingen af sværmer. Sammenlignet med traditionelle metoder til sværmanalyse gør denne time-lapse billeddannelsesmetode det muligt at spore motiliteten af flere sværme samtidigt i længere tid og med høj opløsning. Disse aspekter forbedrer dybden af data, der kan opnås ved overvågning sværme og lette identifikationen af faktorer, der påvirker sværme.
Sværmer i P. aeruginosa lettes gennem produktion og frigivelse af rhamnolipider og 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic syrer i det omkringliggende område6,16. Indførelsen af stress fra sub-dødelige koncentrationer af antibiotika eller infektion med fagvirus påvirker tilrettelæggelsen af sværme. Især disse belastninger fremkalde P. aeruginosa at frigive kvorum sensing molekyle 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolon, også kendt som Pseudomonas quinolon signal (PQS)17,18. I sværmanalyser, der indeholder to populationer af sværme, afviser PQS, der er produceret af den stressinducerede population, ubehandlede sværme i at komme ind i det område, der indeholder stress (figur 1). Denne kollektive stress reaktion udgør en fare kommunikation signalsystem, der advarer P. aeruginosa om nærliggende trusler18,19. Virkningerne af stress på P. aeruginosa, aktivering af den kollektive stress respons, og frastødning af sværme kan visualiseres ved hjælp af time-lapse billeddannelse metode, der er beskrevet her. Den protokol, der er beskrevet her, forklarer, hvordan man: (1) forberede agar plader til sværmer, (2) kultur P. aeruginosa for to typer af assays (traditionelle sværmer assays eller kollektive stress respons assays) (Figur 1), (3) erhverve time-lapse billeder, og (4) bruge ImageJ til at kompilere og analysere billederne.
Kort, P. aeruginosa fra en overnatning kultur er spottet i midten af en sværmer agar plade, mens P. aeruginosa, der er inficeret med eller behandlet med antibiotika er spottet på satellit positioner. Udviklingen af P. aeruginosa sværmer overvåges på et forbrugerdokument flatbed scanner, der er placeret i en fugtighed-reguleret 37 °C inkubator. Scanneren styres af en software, der automatisk scanner pladerne med jævne mellemrum i løbet af sværmvækstperioden, typisk 16-20 timer. Denne metode giver samtidige time-lapse videoer på op til seks 10 cm sværmende plader. Billederne er samlet i film og frastødning af sværme af stress-induceret befolkninger kvantificeres ved hjælp af frit tilgængelige ImageJ software. Der lægges særlig vægt på at sikre konsistens og reproducerbarhed mellem forskellige sværmede eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol fokuserer på at minimere variabiliteten i sværmer agar plader og giver en enkel og billig metode til at erhverve time-lapse billeder af P. aeruginosa sværmer og reagerer på stress. Denne procedure kan udvides til at billedet andre bakterielle systemer ved at tilpasse mediernes sammensætning og vækstbetingelser. For P. aeruginosa, selv om M9 eller FAB minimal medium kan bruges til at fremkalde sværmer16,21, protokollen præs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., og N.M.H-K. skrev og reviderede manuskriptet. Alle forfattere designede eksperimenterne. J.-L.B. udførte eksperimenterne og analysen. Dette arbejde blev støttet af NIH award K22AI112816 og R21AI139968 tilskud til AS og University of California. N.M.H-K. blev støttet af Lundbeck-stipendierne R220-2016-860 og R251-2017-1070. Finansieringsgiverne havde ingen rolle i beslutningen om at forelægge arbejdet til offentliggørelse. Vi har ingen konkurrerende interesser at erklære.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
Referências
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -. L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O’Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
