Imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress
Summary
Nous détaillons une méthode simple pour produire des films à time-lapse haute résolution d’essaims pseudomonas aeruginosa qui répondent à la bactériophage (phage) et au stress antibiotique à l’aide d’un scanner de documents à plat. Cette procédure est une méthode rapide et simple pour surveiller la dynamique des essaims et peut être adaptée pour étudier la motilité et la croissance d’autres espèces bactériennes.
Abstract
L’essaimage est une forme de motilité de surface observée chez de nombreuses espèces bactériennes, y compris Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli. Ici, des populations denses de bactéries se déplacent sur de grandes distances dans les communautés caractéristiques en forme de tendril au cours des heures. L’essaimage est sensible à plusieurs facteurs, y compris l’humidité moyenne, l’humidité et la teneur en éléments nutritifs. En outre, la réponse collective au stress, qui est observée dans P. aeruginosa qui sont stressés par les antibiotiques ou le bactériophage (phage), repousse les essaims de s’approcher de la zone contenant le stress. Les méthodes décrites ici traitent de la façon de contrôler les facteurs critiques qui affectent l’essaimage. Nous introduisons une méthode simple pour surveiller la dynamique des essaims et la réponse collective au stress à haute résolution temporelle à l’aide d’un scanner de documents à plat, et décrivons comment compiler et effectuer une analyse quantitative des essaims. Cette méthode simple et rentable fournit une quantification précise et bien contrôlée des essaimages et peut être étendue à d’autres types d’essais de croissance à base de plaques et d’espèces bactériennes.
Introduction
L’essaimage est une forme collective de motilité bactérienne coordonnée qui augmente la résistance aux antibiotiques et la production de facteurs de virulence dans l’hôte1,2,3. Ce comportement multicellulaire se produit sur les surfaces semi-solides qui ressemblent à celles des couches muqueuses couvrant les membranes épithéliales dans les poumons4,5. Les biosurfacteurs sont généralement produits par des populations grouillantes pour surmonter la tension de surface sur les surfaces et la production de ceux-ci est réglementée par des systèmes complexes de signalisation cellulaire, également connu sous le nom de détection du quorum6,7,8. De nombreuses espèces de bactéries sont capables d’essaimer, y compris Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, et Escherichia coli9,10,11,12. Les modèles d’essaimage créés par les bactéries sont divers et sont affectés par les propriétés physiques et chimiques de la couche de surface, y compris la composition des nutriments, la porosité et l’humidité13,14. En plus des propriétés de surface, la température de croissance et l’humidité ambiante affectent plusieurs aspects de la dynamique des essaimages, y compris le taux d’essaimage et les modèles12,13,14,15. Les variables de croissance qui affectent les essaimages créent des défis qui ont un impact sur la reproductibilité expérimentale et la capacité d’interpréter les résultats. Ici, nous décrivons une méthode standardisée simple pour surveiller la dynamique des essaims bactériens grâce à l’imagerie en time-lapse. La méthode décrit comment contrôler les conditions de croissance critiques qui affectent considérablement la progression de l’essaimage. Par rapport aux méthodes traditionnelles d’analyse des essaims, cette méthode d’imagerie en time-lapse permet de suivre simultanément la motilité de plusieurs essaims pendant de longues périodes et à haute résolution. Ces aspects améliorent la profondeur des données qui peuvent être obtenues en surveillant les essaims et facilitent l’identification des facteurs qui affectent l’essaimage.
L’essaimage dans P. aeruginosa est facilité par la production et la libération de rhamnolipids et 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)acides alplacés dans la zone environnante6,16. L’introduction du stress dû aux concentrations subtaltalgiques d’antibiotiques ou d’infection par le virus du phage a une incidence sur l’organisation d’essaims. En particulier, ces contraintes incitent P. aeruginosa à libérer la molécule de détection du quorum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone, également connu sous le nom pseudomonas quinolone signal (PQS)17,18. Dans les essais d’essaim qui contiennent deux populations d’essaims, le PQS produit par la population induite par le stress repousse les essaims non traités d’entrer dans la région contenant le stress(figure 1). Cette réponse collective au stress constitue un système de signalisation de communication de danger qui avertit P. aeruginosa au sujet des menaces à proximité18,19. Les effets du stress sur P. aeruginosa, l’activation de la réponse collective au stress, et la répulsion des essaims peuvent être visualisés à l’aide de la méthode d’imagerie time-lapse décrite ici. Le protocole décrit ici explique comment : (1) préparer des plaques d’agar pour essaimage, (2) la culture P. aeruginosa pour deux types d’essais (des essais grouillants traditionnels ou des essais collectifs de réponse au stress)(figure 1), (3) acquérir des images en time-lapse, et (4) utiliser ImageJ pour compiler et analyser les images.
En bref, P. aeruginosa d’une culture de nuit est repéré au milieu d’une plaque d’agar grouillant tandis que P. aeruginosa qui sont infectés par le phage ou traités avec des antibiotiques sont repérés aux positions satellites. La progression de l’essaimage de P. aeruginosa est surveillée sur un scanner à plat de documents de consommation qui est placé dans un incubateur de 37 oC régi par l’humidité. Le scanner est contrôlé par un logiciel qui scanne automatiquement les plaques à intervalles réguliers au cours de la période de croissance de l’essaim, généralement 16-20 h. Cette méthode donne des vidéos simultanées en time-lapse de jusqu’à six plaques grouillantes de 10 cm. Les images sont compilées dans des films et la répulsion des essaims par des populations induites par le stress est quantifiée en utilisant un logiciel ImageJ librement disponible. Une attention particulière est accordée pour assurer la cohérence et la reproductibilité entre les différentes expériences d’essaimage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole met l’accent sur la réduction de la variabilité des plaques d’agar grouillantes et la fourniture d’une méthode simple et peu coûteuse pour acquérir des images en time-lapse de P. aeruginosa grouillant et répondant au stress. Cette procédure peut être étendue à l’image d’autres systèmes bactériens en adaptant la composition des médias et les conditions de croissance. Pour P. aeruginosa, bien que M9 ou FAB milieu minimal peut être utilisé pour induire essaimage<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., et N.M.H-K. écrit et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont conçu les expériences. J.-L.B. a effectué les expériences et l’analyse. Ce travail a été soutenu par le prix des NIH K22AI112816 et la subvention R21AI139968 aux A.S. et à l’Université de Californie. N.M.H-K. a reçu l’appui des bourses Lundbeck R220-2016-860 et R251-2017-1070. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la décision de soumettre l’œuvre à la publication. Nous n’avons pas d’intérêts contradictoires à déclarer.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
Referências
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