אנו לפרט שיטה פשוטה כדי לייצר ברזולוציה גבוהה זמן לפקיעה סרטים של פסאודומונס aeruginosa נחילים כי להגיב בקטיויוג’ה (phage) ומתח אנטיביוטי באמצעות סורק מסמך מסורק. הליך זה הוא שיטה מהירה ופשוטה לניטור שורצים הדינמיקה יכול להיות מותאם ללמוד תנועתיות וצמיחה של מינים חיידקיים אחרים.
שורצים היא צורה של תנועתיות פני השטח שנצפו במינים בקטריאליים רבים, כולל הפסאודומונס aeruginosa ואסאנכיה קולי. כאן, אוכלוסיות צפופות של חיידקים לנוע מעל מרחקים גדולים בקהילות בצורת tendril אופייני במהלך השעות. שורצים רגישים למספר גורמים, כולל לחות בינונית, לחות ותוכן תזונתי. בנוסף, תגובת הלחץ הקולקטיבי, אשר נצפתה ב P. aeruginosa , כי הם הדגיש על ידי אנטיביוטיקה או בקטביאג (phage), דוחה נחילים מתקרבים לאזור המכיל את הלחץ. השיטות המתוארות כאן כתובות כיצד לשלוט על הגורמים הקריטיים המשפיעים על שורצים. אנו מציגים שיטה פשוטה לפקח על שורצים הדינמיקה ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי עם ברזולוציה גבוהה בזמן באמצעות סורק מסמך מסורק, ולתאר כיצד לקמפל ולבצע ניתוח כמותי של נחילים. שיטה פשוטה וחסכונית זו מספקת כימות מדויקת ומבוקרת היטב של שורצים ועשויים להיות מורחבים לסוגים אחרים של הצלחת הצמיחה המבוססת על לוח ומינים חיידקי.
שורצים היא צורה קולקטיבית של תנועתיות בקטריאלי מתואמת המגביר עמידות לאנטיביוטיקה והפקת גורמי התקפה אלימה במחשב המארח1,2,3. התנהגות זו רב-תאיים מתרחשת על משטחים חצי מוצקים הדומים לאלה של שכבות ריריות המכסים ממברנות אפיתל בריאות4,5. ביוסוררים מיוצרים בדרך כלל על ידי אוכלוסיות שורצים כדי להתגבר על מתח פני השטח על משטחים ועל הייצור של אלה מוסדר על ידי תא התא מורכב איתות מערכות, הידוע גם כ-quorum חישה6,7,8. מינים רבים של חיידקים מסוגלים שורצים, כולל הפסאודומונס aeruginosa, סטייהולוקוקוס האוראוס, ואסאנכיה קולי9,10,11,12. דפוסי השמון שנוצרו על ידי חיידקים הם מגוונים ומושפעים התכונות הפיזיות והכימיות של שכבת פני השטח כולל הרכב מזינים, פורמים, ולחות13,14. בנוסף למאפייני פני השטח, טמפרטורת הצמיחה ולחות הסביבה משפיעים על מספר היבטים של שורצים, כולל שיעור שורצים ודפוסים12,13,14,15. משתני הצמיחה המשפיעים על שורצים ליצור אתגרים המשפיעים על התוכסות ניסיוני ואת היכולת לפרש את התוצאות. כאן, אנו מתארים שיטה סטנדרטית פשוטה כדי לפקח על הדינמיקה של נחילי בקטריאלי דרך הדמיה זמן לשגות. השיטה מתארת כיצד לשלוט בתנאי גדילה קריטיים המשפיעים באופן משמעותי על ההתקדמות של שורצים. בהשוואה לשיטות מסורתיות של ניתוח נחיל, זו שיטת הדמיה הזמן מאפשר לעקוב אחר תנועתיות של נחילים מרובים במקביל במהלך פרקי זמן ארוכים עם רזולוציה גבוהה. היבטים אלה משפרים את עומק הנתונים שניתן להשיג מהנחילים לניטור ולהקל על זיהוי גורמים המשפיעים על שורצים.
שורצים P. aerginosa הוא הקלה דרך הייצור ושחרורו של הרחמנויפידים ו-3-(3-הידרוקסילואנוק) חומצות אלקאנומית לאזור שמסביב6,16. המבוא של לחץ מתוך ריכוזי תת קטלני של אנטיביוטיקה או זיהום על ידי וירוס phage משפיע על הארגון של נחילים. במיוחד, הלחצים האלה לגרום P. aeruginosa לשחרר את מולקולה חישה 2-הפלטיל-3-הידרוxy-4-quinolone, הידוע גם בשם האות הפסאודומונס quinolone (pqs)17,18. בתוך הנחיל אומר כי מכילים שתי אוכלוסיות של נחילים, PQS המיוצר על ידי האוכלוסייה הנגרמת לחץ דוחה נחילים מטופל מלהיכנס לאזור המכיל את הלחץ (איור 1). תגובת הדחק הקולקטיבית מהווה מערכת מסוכנת לתקשורת איתות המזהירה את P. aeruginosa על איומים סמוכים18,19. השפעת הלחץ על P. aeruginosa, הפעלת תגובת הלחץ הקולקטיבי, ואת הדחייה של נחילים ניתן לדמיין באמצעות שיטת הדמיה בזמן שתוארה כאן. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד: (1) להכין צלחות אגר עבור שורצים, (2) תרבות P. aeruginosa עבור שני סוגים של בחני (שורצים מסורתיים או תגובת הלחץ קולקטיבית התגובה) (איור 1), (3) לרכוש תמונות זמן, ו (4) להשתמש imagej לקמפל ולנתח את התמונות
בקצרה, P. aerginosa מן התרבות לילה הוא הבחין באמצע הלוח שורצים בזמן P. aeruginosa כי הם נגועים phage או מטופלים עם אנטיביוטיקה מאותרת בעמדות לווין. ההתקדמות של P. aeruginosa שורצים מנוטרים על מסמך הצרכן סורק שנמצא ממוקם בתוך לחות מוסדר 37 ° c אינקובטור. הסורק נשלט על ידי תוכנה שסורקת באופן אוטומטי את הצלחות במרווחי זמן קבועים על תקופת הצמיחה נחיל, בדרך כלל 16 – 20 h. שיטה זו מפיקה במקביל סרטוני וידאו של עד 6 10 ס”מ לוחות שורצים. התמונות מצולמות בסרטים והדחייה של הנחילים על ידי אוכלוסיות מוחלשות מקוונזת באמצעות תוכנת ImageJ זמינה באופן חופשי. שיקול מיוחד ניתן כדי להבטיח עקביות והתמדה בין ניסויים שורצים שונים.
פרוטוקול זה מתמקד בצמצום השונות בלוחות שורצים באגר ומספק שיטה פשוטה ובעלות נמוכה לרכישת תמונות בזמן של P. aeruginosa שורצים ומגיבים ללחץ. הליך זה ניתן להרחיב את התמונה מערכות בקטריאלי אחרות על ידי התאמת הרכב התקשורת ותנאי גדילה. עבור P. aeruginosa, למרות M9 או בינוני מינימלי FAB יכול לשמש כדי ל…
The authors have nothing to disclose.
י.-ל ג’ונסון, א. י., ו. מ. ק. ה. כתב ושינו את כתב היד. כל המחברים תכננו את הניסויים. ג.-ל ג’ונסון ביצעו את הניסויים והניתוח. עבודה זו נתמכת על ידי K22AI112816 בפרס NIH ו-R21AI139968 מענק ל-ס. י. ובאוניברסיטת קליפורניה. נ. מ. ח-ק בתמיכת מלגות לונלבק R220-2016-860 וR251-2017-1070. לתורמים לא היה כל תפקיד בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום. . אין לנו אינטרסים מתחרים להכריז
Reagents | |||
Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
Strains | |||
Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
Supplies | |||
Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
Equipment | |||
Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |