बैक्टीरियल झुंड और सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया की समय चूक इमेजिंग
Summary
हम स्यूडोमोनास एरुजिनोसा झुंड ों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन समय-चूक फिल्मों का उत्पादन करने के लिए एक सरल विधि का विस्तार करते हैं जो फ्लैटबेड दस्तावेज़ स्कैनर का उपयोग करके बैक्टीरियोफेज (फेज) और एंटीबायोटिक तनाव का जवाब देते हैं। यह प्रक्रिया झुंड गतिशीलता की निगरानी के लिए एक तेज और सरल विधि है और अन्य जीवाणु प्रजातियों के गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
झुंड सतह का एक रूप है जो स्यूडोमोनास एरुजिनोसा और एस्चेरिचिया कोलाईसहित कई जीवाणु प्रजातियों में देखा जाता है । यहां, बैक्टीरिया की घनी आबादी घंटों के दौरान विशिष्ट टेंड्रल के आकार के समुदायों में बड़ी दूरी पर जाती है। झुंड मध्यम नमी, आर्द्रता और पोषक तत्वों की सामग्री सहित कई कारकों के प्रति संवेदनशील है। इसके अलावा, सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया, जो पी एरुजिनोसा में मनाई जाती है जो एंटीबायोटिक ्स या बैक्टीरियोफेज (फेज) द्वारा जोर दिया जाता है, तनाव वाले क्षेत्र में आने से झुंड को पीछे हटा देता है। यहां वर्णित विधियां झुंड को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारकों को नियंत्रित करने के तरीके को संबोधित करती हैं। हम एक सपाट दस्तावेज़ स्कैनर का उपयोग करके उच्च लौकिक संकल्प के साथ झुंड की गतिशीलता और सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए एक सरल विधि पेश करते हैं, और वर्णित करते हैं कि झुंडों का मात्रात्मक विश्लेषण कैसे संकलित और प्रदर्शन किया जाए। यह सरल और लागत प्रभावी विधि झुंड के सटीक और अच्छी तरह से नियंत्रित मात्रा प्रदान करता है और प्लेट आधारित विकास परख और जीवाणु प्रजातियों के अंय प्रकार के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
Introduction
झुंड समन्वित जीवाणु गतिशीलता का एक सामूहिक रूप है जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध को बढ़ाता है और मेजबान1,2,3में उग्रता कारकों का उत्पादन करता है । यह बहुकोशिकीय व्यवहार अर्ध-ठोस सतहों पर होता है जो फेफड़ोंमेंएपिथेलियल झिल्ली को कवर करने वाले श्लेष्म परतों के समान होते हैं 4,5। सतहों पर सतह के तनाव को दूर करने के लिए आमतौर पर झुंड वाली आबादी द्वारा बायोसर्फेक्टेंट का उत्पादन किया जाता है और इनके उत्पादन को जटिल सेल-सेल सिग्नलिंग सिस्टम द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसे कोरम सेंसिंग6,7,7,8के रूप में भी जाना जाता है। बैक्टीरिया की कई प्रजातियां झुंड में सक्षम हैं, जिनमें स्यूडोमोनास एरुजिनोसा, स्टेफिलोकोकस ऑरियसऔर एस्चेरिचिया कोलाई9,10,,11,,12शामिल हैं। बैक्टीरिया द्वारा बनाए गए झुंड के पैटर्न विविध होते हैं और पोषक तत्वों की संरचना, porosity, और नमी13,,14सहित सतह परत के भौतिक और रासायनिक गुणों से प्रभावित होते हैं । सतही गुणों के अलावा, विकास तापमान और परिवेश आर्द्रता झुंड की गतिशीलता के कई पहलुओं को प्रभावित करती है, जिसमें झुंड की दर और पैटर्न12,,13,,14,,15शामिल हैं। झुंड को प्रभावित करने वाले विकास चर चुनौतियां पैदा करते हैं जो प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता और परिणामों की व्याख्या करने की क्षमता को प्रभावित करते हैं। यहां, हम समय-चूक इमेजिंग के माध्यम से बैक्टीरियल झुंड की गतिशीलता की निगरानी करने के लिए एक सरल मानकीकृत विधि का वर्णन करते हैं। विधि का वर्णन कैसे महत्वपूर्ण विकास की स्थिति है कि काफी झुंड की प्रगति को प्रभावित को नियंत्रित करने के लिए । झुंड विश्लेषण के पारंपरिक तरीकों की तुलना में, इस समय चूक इमेजिंग विधि समय की विस्तारित अवधि के दौरान और उच्च संकल्प के साथ समवर्ती रूप से कई झुंडों की गतिशीलता पर नज़र रखने में सक्षम बनाता है। ये पहलू डेटा की गहराई में सुधार करते हैं जिन्हें झुंडों की निगरानी से प्राप्त किया जा सकता है और झुंड को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान को सुगम बना सकता है।
पी aeruginosa में झुंड उत्पादन और rhamnolipids और 3-(3-हाइड्रोक्सीअलाकानोइलोक्सी) क्षारनोइक एसिड के आसपास के क्षेत्र6,,16में जारी करने के माध्यम से सुविधा है । एंटीबायोटिक दवाओं या phage वायरस द्वारा संक्रमण की उप घातक सांद्रता से तनाव की शुरूआत झुंड के संगठन को प्रभावित करता है । विशेष रूप से, ये तनाव पी एरुजिनोसा को कोरम संवेदन अणु 2-हेप्टिल-3-हाइड्रोक्सी-4-क्विनोलोन को छोड़ने के लिए प्रेरित करते हैं, जिसे स्यूडोमोनास क्विनोलोन सिग्नल (पीक्यूएस)17,,18के रूप में भी जाना जाता है। झुंड की परख में है कि झुंड की दो आबादी होते हैं, PQS तनाव से प्रेरित आबादी द्वारा उत्पादित तनाव युक्त क्षेत्र में प्रवेश करने से अनुपचारित झुंड repels(चित्रा 1)। यह सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया एक खतरे संचार सिग्नलिंग प्रणाली का गठन करती है जो पी एरुजिनोसा को आसपास के खतरों18,,19के बारे में चेतावनी देती है । पी aeruginosaपर तनाव के प्रभाव, सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया की सक्रियता, और झुंड के प्रतिकर्षण समय चूक इमेजिंग विधि का उपयोग कर यहां वर्णित कल्पना की जा सकती है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे करें: (1) झुंड के लिए आगर प्लेटें तैयार करें, (2) संस्कृति पी aeruginosa दो प्रकार के परखों के लिए (पारंपरिक झुंड परख या सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया परख)(चित्र 1), (3)समय चूक छवियों को प्राप्त करने, और (4) छवियों को संकलित करने और विश्लेषण करने के लिए ImageJ का उपयोग करें ।
संक्षेप में, एक रात की संस्कृति से पी aeruginosa एक झुंड आगर प्लेट के बीच में देखा जाता है, जबकि पी aeruginosa कि phage से संक्रमित है या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज उपग्रह पदों पर देखा जाता है । पी aeruginosa झुंड की प्रगति एक उपभोक्ता दस्तावेज़ फ्लैटबेड स्कैनर है कि एक आर्द्रता विनियमित ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है पर नजर रखी है । स्कैनर को एक सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो स्वचालित रूप से झुंड विकास अवधि में नियमित अंतराल पर प्लेटों को स्कैन करता है, आमतौर पर 16-20 घंटे। इस विधि से छह 10 सेमी तक की प्लेटों के समवर्ती समय-चूक वीडियो पैदा होते हैं। छवियों को फिल्मों में संकलित किया जाता है और तनाव-प्रेरित आबादी द्वारा झुंडों का प्रतिकर्षण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। विभिन्न झुंड प्रयोगों के बीच स्थिरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल झुंड आगर प्लेटों में परिवर्तनशीलता को कम करने और पी aeruginosa झुंड और तनाव का जवाब देने के समय चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए एक सरल और कम लागत विधि प्रदान करने पर केंद्रित है । इस प्रक्रिय?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जे-एलएलबी, एएस, और N.M.H.K. पांडुलिपि लिखी और संशोधित की। सभी लेखकों ने प्रयोगों को डिजाइन किया। जे-एलएलबी ने प्रयोगों और विश्लेषण का प्रदर्शन किया । इस काम को एनआईएच पुरस्कार K22AI112816 और R21AI139968 अनुदान एएस और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। N.M.H.K लुंडबेक फैलोशिप R220-2016-860 और R251-2017-1070 द्वारा समर्थित किया गया था । प्रकाशन के लिए काम जमा करने के फैसले में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी । हमारे पास घोषणा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है ।
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
Referências
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