L'imaging time-lapse di sciami batterici e la risposta allo stress collettivo
Summary
Dettagliamo un metodo semplice per produrre filmati time-lapse ad alta risoluzione di sciami di Pseudomonas aeruginosa che rispondono a batteriofa (fago) e stress antibiotico utilizzando uno scanner di documenti piatti. Questa procedura è un metodo semplice e veloce per monitorare le dinamiche dello sciame e può essere adattata per studiare la motilità e la crescita di altre specie batteriche.
Abstract
Lo sciame è una forma di motilità superficiale osservata in molte specie batteriche tra cui Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli. Qui, le popolazioni dense di batteri si muovono su grandi distanze in comunità a forma di tendine nel corso delle ore. Lo sciame è sensibile a diversi fattori, tra cui umidità media, umidità e contenuto di nutrienti. Inoltre, la risposta collettiva allo stress, che si osserva in P. aeruginosa che sono stressati da antibiotici o batteriofagi (fago), respinge sciami dall’avvicinarsi all’area contenente lo stress. I metodi descritti di seguito riguardano il modo in cui controllare i fattori critici che influiscono sullo sciame. Introduciamo un metodo semplice per monitorare le dinamiche dello sciame e la risposta collettiva allo stress con alta risoluzione temporale utilizzando uno scanner di documenti piano e descriviamo come compilare ed eseguire un’analisi quantitativa degli sciami. Questo metodo semplice ed economico fornisce una quantificazione precisa e ben controllata dello sciame e può essere esteso ad altri tipi di saggi di crescita a base di lamiere e specie batteriche.
Introduction
Lo sciame è una forma collettiva di motilità batterica coordinata che aumenta la resistenza agli antibiotici e la produzione di fattori di virulenza nell’host1,2,3. Questo comportamento multicellulare si verifica su superfici semi-solide che assomigliano a quelle degli strati mucose che coprono le membrane epiteliali nei polmoni4,5. I biosurfactants sono comunemente prodotti da popolazioni brulicanti per superare la tensione superficiale sulle superfici e la produzione di questi è regolata da complessi sistemi di segnalazione cellulare, noti anche come quorum sensing6,7,8. Molte specie di batteri sono in grado di sciamare, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Escherichia coli9,10,11,12. I modelli brulicanti creati dai batteri sono diversi e sono influenzati dalle proprietà fisiche e chimiche dello strato superficiale tra cui la composizione dei nutrienti, porosità, e l’umidità13,14. Oltre alle proprietà della superficie, la temperatura di crescita e l’umidità ambiente influenzano diversi aspetti della dinamica dello sciame, tra cui il tasso di bruliè e modelli12,13,14,15. Le variabili di crescita che influenzano lo sciame creano sfide che influenzano la riproducibilità sperimentale e la capacità di interpretare i risultati. Qui, descriviamo un semplice metodo standardizzato per monitorare la dinamica degli sciami batterici attraverso l’imaging time-lapse. Il metodo descrive come controllare le condizioni di crescita critiche che influenzano in modo significativo la progressione dello sciame. Rispetto ai metodi tradizionali di analisi dello sciame, questo metodo di imaging time-lapse consente di monitorare la motilità di più sciami contemporaneamente durante lunghi periodi di tempo e ad alta risoluzione. Questi aspetti migliorano la profondità dei dati che possono essere ottenuti monitorando sciami e facilitano l’identificazione dei fattori che influenzano lo sciame.
Lo sciame in P. aeruginosa è facilitato attraverso la produzione e il rilascio di rhamnolipids e 3-(3-idrossi-idrossinoyloxy)accomodanti nell’area circostante6,16. L’introduzione dello stress da concentrazioni subletali di antibiotici o infezioni da virus del fago influisce sull’organizzazione di sciami. In particolare, queste sollecitazioni inducono P. aeruginosa a rilasciare la molecola di rilevamento quorum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone, noto anche come il segnale di quinolone Pseudomonas (PQS)17,18. Nei test sciami che contengono due popolazioni di sciami, il PQS prodotto dalla popolazione indotta dallo stress respinge gli sciami non trattati dall’entrare nell’area contenente lo stress (Figura 1). Questa risposta collettiva allo stress costituisce un sistema di segnalazione di comunicazione di pericolo che avverte P. aeruginosa sulle minacce vicine18,19. Gli effetti dello stress su P. aeruginosa, l’attivazione della risposta collettiva allo stress, e la repulsione degli sciami possono essere visualizzati utilizzando il metodo di imaging time-lapse descritto qui. Il protocollo qui descritto spiega come: (1) preparare piastre di agar per brulicare, (2) cultura P. aeruginosa per due tipi di analisi (saggi tradizionali sciami o saggi collettivi di risposta allo stress) (Figura 1), (3) acquisire immagini time-lapse e (4) utilizzare ImageJ per compilare e analizzare le immagini.
In breve, P. aeruginosa da una coltura durante la notte è avvistato nel mezzo di una piastra di agar brulicante mentre P. aeruginosa che sono infettati da fago o trattati con antibiotici sono avvistati nelle posizioni satellitari. La progressione dello sciame di P. aeruginosa è monitorata su uno scanner piano piano del documento di consumo che viene collocato in un’incubatrice regolata dall’umidità di 37 gradi centigradi. Lo scanner è controllato da un software che esegue automaticamente la scansione delle piastre a intervalli regolari durante il periodo di crescita dello sciame, in genere 16-20 h. Questo metodo produce video time-lapse simultanei fino a sei piastre brulicanti di 10 cm. Le immagini vengono compilate in filmati e la repulsione di sciami da parte di popolazioni indotte da stress è quantificata utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile. Si fa particolare attenzione a garantire la coerenza e la riproducibilità tra i diversi esperimenti di brulicante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo si concentra sulla riduzione al minimo della variabilità nelle piastre di agar brulicanti e sulla fornitura di un metodo semplice e a basso costo per acquisire immagini time-lapse di P. aeruginosa brulicante e rispondendo allo stress. Questa procedura può essere estesa per l’immagine di altri sistemi batterici adattando la composizione dei media e le condizioni di crescita. Per P. aeruginosa, anche se M9 o FAB mezzo minimo può essere utilizzato per indurre sciami16…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., e N.M.H-K. scritto e rivisto il manoscritto. Tutti gli autori hanno progettato gli esperimenti. J.–L.B. ha eseguito gli esperimenti e l’analisi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH K22AI112816 e R21AI139968 ad A.S. e dall’Università della California. N.M.H-K. è stato supportato da Lundbeck Fellowships R220-2016-860 e R251-2017-1070. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella decisione di presentare i lavori per la pubblicazione. Non abbiamo interessi contrastanti da dichiarare.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
Referências
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