Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés
Summary
Detallamos un método simple para producir películas de lapso de tiempo de alta resolución de enjambres Pseudomonas aeruginosa que responden al bacteriófago (fago) y estrés antibiótico utilizando un escáner de documentos de base plana. Este procedimiento es un método rápido y sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y puede adaptarse para estudiar la motilidad y el crecimiento de otras especies bacterianas.
Abstract
El enjambre es una forma de motilidad superficial observada en muchas especies bacterianas incluyendo Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Aquí, las poblaciones densas de bacterias se mueven a grandes distancias en comunidades características en forma de zarcillo en el transcurso de horas. El enjambre es sensible a varios factores, incluyendo humedad media, humedad y contenido de nutrientes. Además, la respuesta al estrés colectivo, que se observa en P. aeruginosa que se estresa con antibióticos o bacteriófagos (fago), repele que los enjambres se acerquen a la zona que contiene el estrés. Los métodos descritos aquí abordan cómo controlar los factores críticos que afectan al enjambre. Presentamos un método sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y la respuesta de tensión colectiva con alta resolución temporal usando un escáner de documentos de base plana, y describimos cómo compilar y realizar un análisis cuantitativo de enjambres. Este método simple y rentable proporciona una cuantificación precisa y bien controlada del enjambre y puede extenderse a otros tipos de ensayos de crecimiento a base de placas y especies bacterianas.
Introduction
El enjambre es una forma colectiva de motilidad bacteriana coordinada que aumenta la resistencia a los antibióticos y la producción de factores de virulencia en el huésped1,2,3. Este comportamiento multicelular ocurre en superficies semisólidas que se asemejan a las de las capas mucosas que cubren las membranas epiteliales en los pulmones4,5. Los biosurfactantes son comúnmente producidos por poblaciones enjambres para superar la tensión superficial en las superficies y la producción de estos está regulada por complejos sistemas de señalización de células celulares, también conocidos como cuórum de sensato6,7,8. Muchas especies de bacterias son capaces de enjambre, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,y Escherichia coli9,10,11,12. Los patrones de enjambre creados por las bacterias son diversos y se ven afectados por las propiedades físicas y químicas de la capa superficial, incluyendo la composición de nutrientes, porosidad y humedad13,14. Además de las propiedades de la superficie, la temperatura de crecimiento y la humedad ambiental afectan a varios aspectos de la dinámica de enjambre, incluyendo la tasa de enjambre y los patrones12,,13,,14,,15. Las variables de crecimiento que afectan al enjambre crean desafíos que afectan la reproducibilidad experimental y la capacidad de interpretar los resultados. Aquí, describimos un método estandarizado simple para monitorear la dinámica de los enjambres bacterianos a través de imágenes de lapso de tiempo. El método describe cómo controlar las condiciones críticas de crecimiento que afectan significativamente la progresión del enjambre. En comparación con los métodos tradicionales de análisis de enjambres, este método de imágenes de lapso de tiempo permite realizar un seguimiento de la motilidad de múltiples enjambres simultáneamente durante períodos prolongados de tiempo y con alta resolución. Estos aspectos mejoran la profundidad de los datos que se pueden obtener de la supervisión de enjambres y facilitan la identificación de los factores que afectan el enjambre.
El enjambre en P. aeruginosa se facilita a través de la producción y liberación de ácidos rhamnolipids y 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic en el área circundante6,16. La introducción del estrés a partir de concentraciones subletales de antibióticos o infección por el virus del fago afecta la organización de enjambres. En particular, estas tensiones inducen a P. aeruginosa a liberar la molécula de sensibilidad de quórum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolona, también conocida como la señal de quinolona Pseudomonas (PQS)17,18. En los ensayos de enjambres que contienen dos poblaciones de enjambres, los PQS producidos por la población inducida por el estrés repele que los enjambres no tratados entren en el área que contiene la tensión (Figura 1). Esta respuesta de estrés colectivo constituye un sistema de señalización de comunicación de peligro que advierte a P. aeruginosa sobre amenazas cercanas18,,19. Los efectos del estrés en P. aeruginosa, la activación de la respuesta de estrés colectivo y la repulsión de enjambres se pueden visualizar utilizando el método de imagen de lapso de tiempo descrito aquí. El protocolo descrito aquí explica cómo: (1) preparar placas de agar para enjambre, (2) cultivo P. aeruginosa para dos tipos de ensayos (ensayos de enjambre tradicionales o ensayos de respuesta de estrés colectivo)(Figura 1), (3) adquirir imágenes de lapso de tiempo, y (4) utilizar ImageJ para compilar y analizar las imágenes.
Brevemente, P. aeruginosa de un cultivo nocturno se ve en medio de una placa de agar enjambre, mientras que P. aeruginosa que están infectados con fago o tratados con antibióticos son vistos en las posiciones del satélite. La progresión del enjambre de P. aeruginosa se supervisa en un escáner de cama plana de documentos de consumo que se coloca en una incubadora de 37 oC regulada por humedad. El escáner está controlado por un software que escanea automáticamente las placas a intervalos regulares durante el período de crecimiento del enjambre, normalmente de 16 a 20 h. Este método produce videos simultáneos de lapso de tiempo de hasta seis placas de enjambre de 10 cm. Las imágenes se compilan en películas y la repulsión de enjambres por poblaciones inducidas por el estrés se cuantifica mediante el uso de software ImageJ disponible libremente. Se presta especial atención a garantizar la coherencia y reproducibilidad entre los diferentes experimentos de enjambre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se centra en minimizar la variabilidad en las placas de agar enjambre y proporcionar un método simple y de bajo costo para adquirir imágenes de lapso de tiempo de P. aeruginosa enjambre y responder al estrés. Este procedimiento se puede extender a la imagen de otros sistemas bacterianos mediante la adaptación de la composición de los medios y las condiciones de crecimiento. Para P. aeruginosa,aunque M9 o FAB medio mínimo se puede utilizar para inducir enjambre16</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., y N.M.H-K. escribió y revisó el manuscrito. Todos los autores diseñaron los experimentos. J.-L.B. realizó los experimentos y análisis. Este trabajo fue apoyado por el premio NIH K22AI112816 y la concesión R21AI139968 a A.S. y por la Universidad de California. N.M.H-K. fue apoyado por las Becas Lundbeck R220-2016-860 y R251-2017-1070. Los funderos no tuvieron ningún papel en la decisión de presentar la obra para su publicación. No tenemos intereses que declarar.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
Referências
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