マウスにおける大腸誘導ピンチ生検の実施と、その後の組織変化の評価
Summary
ここでは、マウスにおける大腸誘導ピンチ生検を誘導し、創傷閉鎖をリアルタイムで追跡する手順の詳細な説明を提供する。さらに、創傷床の組織学的、免疫組織化学的および分子的分析のための組織の調製方法が提供される。
Abstract
急性傷害反応および創傷治癒過程で起こる組織および細胞変化を理解することは、消化管(GI)管の疾患を研究する際に最も重要である。マウスコロニーピンチ生検モデルは、これらのプロセスを定義するのに有用なツールです。さらに、腸の発光含有量(例えば、微生物)と結腸間の相互作用を研究することができる。しかし、創傷の誘導と信頼性の高い方法で時間をかけて創傷閉鎖を追跡する能力は困難な場合があります。さらに、組織の準備と向きは、組織学的および分子的変化を最適に問い合わすために標準化された方法で行わなければならない。ここでは、生検による傷害と繰り返し大腸内視鏡検査による創傷閉鎖のモニタリングを説明する詳細な方法を提示する。創傷サイズの一貫した再現性の測定、分子分析のために創傷床を収集する能力、組織の切断時に創傷床を視覚化する機能を保証するアプローチが記載されています。これらの技術を正常に実行する能力は、急性傷害応答、創傷治癒および結腸内の発光宿主相互作用の研究を可能にする。
Introduction
消化管(GI)は、その多くの機能、宿主細胞型(例えば上皮、免疫、間質など)、および数兆個の微生物を与えられた複雑な器官系である。この複雑さに照らして、消化管の疾患は、多くの場合、これらの要因の相互作用を伴う。例えば、炎症性腸疾患(IBD)は、消化管における炎症および寛解のサイクルに関連しており、炎症性細胞の活性化、ジスビオシス、および上皮修復1、2、3、4、5、6、7を含む。IBDおよびGI管の他の炎症性状態を研究するための適切なモデルシステムを有することは、疾患の病因を解明するために重要である。遺伝子組み換えマウスを含むIBDの病態を研究するためにいくつかのモデルが存在し、げっ歯類におけるデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)などの化学物質の使用8,9,10.これらのモデルの制限には、炎症の誘導を正確に制御できないことと、創傷治癒の評価における困難が含まれる。IBD病因の側面を模倣する別の方法は、治療法の開発に有用であることが証明できる。
マウスにおける大腸誘導ピンチ生検は、炎症反応の病因、創傷治癒、ならびに結腸における宿主と微生物の相互作用を研究するのに有用なモデルシステムを提供する。このアプローチは、2009年に実験的なツールとして初めて使用され、腸内の急性炎症反応および創傷治癒を研究するための有用性を実証した。その後の研究では、腸内微生物叢と同様に異なるシグナル伝達経路の役割を評価するためにこの技術を利用し、大腸創傷治癒11、12、13、14、15、16、17、18。最近では、このモデルを用いて、大腸損傷に対する急性応答におけるスフィンゴシン-1-リン酸シグナル伝達と細菌の重要性を調べた。有用であるが、マウスで大腸誘導ピンチ生検を行い、その後の組織の変化を評価することは技術的に困難であり得る。例えば、腸の穿穿は傷害の誘発時に起こり得、連続大腸内視鏡検査を通して創傷床の一貫した測定を保障することは困難であり得る。さらに、組織学的または免疫組織化学的分析のために創傷床を視覚化するために大腸組織を適切に配向させることは困難であり得る。これらの方法18、20に関するいくつかの情報が存在するが、これらの技術の正確なステップワイズの記述は、視覚補助は、このモデルの信頼性と広範な有用性を強化することを約束するであろう。ここでは、マウスで大腸誘導ピンチ生検を行い、時間の経過とともに創傷閉鎖を追跡し、創傷床の組織学的および分子的分析を可能にする組織を準備するための詳細な方法を提示する。これらの技術を実行するための標準的な方法を作成すると、このモデルの使用を拡大して、GIの炎症および創傷修復にとって潜在的に重要である未調査のメディエーターを研究することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このモデルで創傷閉鎖率を効果的に評価しようとする際には、一貫した正確な生検と創傷サイズの測定を確実にすることが最も重要です。したがって、手順が正しく実行されていることを確信するために、いくつかの措置を講じる必要があります。第一に、生検の深さは浅すぎたり深すぎたりしてはならない。浅すぎると、創傷閉鎖を評価するのに十分な窓がありません。 図…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、クローン病大腸炎財団(D.C.M)とニューヨーククローン財団(D.C.MとA.J.D.)からの助成金によって支えられました。著者らは、この記事のビデオ伴奏の作成に協力してくれたカルメン・フェラーラ氏に感謝します。
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
Referências
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
