Summary
Этот протокол описывает in vivo анализ фагоцитоза, используемого для оценки и количественной оценки способности молодых и в возрасте Drosophila melanogaster гемоцитов к бактериям фагоцитозы.
Abstract
Фагоцитоз является важной функцией врожденного иммунного ответа. Этот процесс осуществляется фагоцитными гемоцитами, основной функцией которых является распознавание широкого спектра частиц и уничтожение микробных патогенов. С возрастом организмов этот процесс начинает снижаться, однако мало что известно о базовых механизмах или генетической основе иммуносенелесции. Здесь, инъекция, основанная в vivo фагоцитоз анализ используется для оценки возрастных изменений в различных аспектах фагоцитоза, таких как связывание, поглощение, и деградация интернализированных частиц, путем количественной оценки фагоцитных событий в гемоцитах у взрослых Drosophila. Drosophila melanogaster стал идеальной моделью для изучения возрастных изменений в врожденной иммунной функции по многим причинам. С одной стороны, многие генетические компоненты и функции врожденного иммунного ответа, включая фагоцитоз, эволюционно сохраняются между дрозофилой и млекопитающими. Из-за этого результаты, полученные от использования этого протокола, вероятно, будут широко актуальны для понимания возрастных изменений в иммунной функции в различных организмах. Кроме того, мы отмечаем, что этот метод обеспечивает количественные оценки фагоцитной способности гемоцитов, которые могут быть полезны для различных тем исследования, и не должны ограничиваться исследованиями старения.
Introduction
Врожденная иммунная система, которая состоит из физических и химических барьеров для инфекции, а также клеточных компонентов, эволюционно сохраняется через многоклеточные организмы1,2. Как первая линия обороны, врожденная иммунная система играет важную роль в борьбе с вторжением патогенов у всех животных1,,2,3. Компоненты врожденного иммунного ответа включают широкий спектр типов клеток, которые классифицируются на том основании, что им не хватает специфичности и иммунологической памяти2,,3,,4. У людей эти типы клеток включают фагоцитные моноциты и макрофаги, нейтрофилы и цитотоксические естественные клетки-убийцы4,,5. Хотя наличие функциональной иммунной системы является необходимым для выживания хозяина, ясно, что функция иммунных клеток снижается с возрастом, явление, известное как иммуносенессация5,6. Возможность оценить возрастные изменения иммунного ответа, включая различные аспекты процесса фагоцитоза, может помочь в нашем понимании иммуносенекции. Процедура, которую мы описываем здесь, обеспечивает эффективный и повторяемый подход к оценке и количественной оценке фагоцитных событий гемоцитами в drosophila melanogaster.
Дрозофила является идеальной моделью для изучения иммунного ответа по многим причинам. С одной, есть обширный набор генетических инструментов, которые позволяют легко манипулировать экспрессией генов в ткани зависит образом7. Эти инструменты включают в себя коллекцию мутантов, запасы РНК-интерференции, запасы GAL4/UAS и генетическую справочную панель Drosophila, которая содержит 205 различных инбредных линий, для которых каталогизуются все последовательности генома8. Короткий жизненный цикл Drosophila и большое количество людей, произведенных позволяют исследователям проверить несколько человек в контролируемой среде, в течение короткого периода времени. Это значительно повышает способность выявлять тонкие различия в иммунных реакциях на инфекции среди генотипов, между полами или в разных возрастных группах. Важно отметить, что многие генетические компоненты и функции врожденного иммунного ответа, в том числе фагоцитоз, эволюционно сохраняются между дрозофилой и млекопитающими1,2.
В Drosophila, процесс фагоцитоза, который следует инфекции осуществляется фагоцитатических гемоцитов называется плазматоцитов, которые эквивалентны млекопитающих макрофагов9. Гемоциты необходимы для распознавания широкого спектра частиц и очистки микробных патогенов9,,10,,11,,12,,13. Эти клетки выражают различные рецепторы, которые должны дифференцировать себя от не-я, и инициировать сигнальные события, необходимые для выполнения фагоцитного процесса10,11,,12,13,14,15. Как только частица связана, она начинает быть интернализирована путем реорганизации актин цитоскелета и реконструкции плазменной мембраны, чтобы расширить вокруг частицы, образуя фагоцитный стакан11,12,13,14. Во время этого процесса, другой набор сигналов говорит клетке, чтобы усвоить частицу дальше, закрыв фагоцитарная чашка, образуя мембрану связаны фагосом11,12,13,14,15. Фагосом затем проходит процесс созревания, связывая с различными белками и сплавляясь с лизосомами, образуя кислый фаголисом11,12,13,14,15. На данный момент частицы могут эффективно деградировать иустранять 11,,12,,13,,14,,15. Исследования дрозофилы показали, что старые мухи (4 недели) имеют пониженную способность к очистке инфекции по сравнению с молодыми мухами (1-недельный), вероятно, из-за, по крайней мере частично, к снижению в некоторых аспектах фагоцитоза16,17.
Метод, описанный здесь, использует два отдельных флуоресцентно-маркированных тепловой убитой кишечной палочки частиц, один подшипник стандартный фторфор и один, который является рН чувствительны, для оценки двух различных аспектов фагоцитоза: первоначальное поглощение частиц, и деградация частиц в фаголизоме. В этом анализе флуоресценция фтор-частицы наблюдается, когда частицы связаны и поглощены гемоцитами, в то время как рН чувствительных частиц флуоресцирует только в условиях низкого рН фагосомы. Флуоресцентные события могут наблюдаться в гемоцитах, которые локализуются вдоль спинного сосуда. Мы фокусируемся на гемоцитах, локализованных в спинном сосуде, которые обеспечивают анатомическую ориентир для поиска гемоцитов, которые, как известно, способствуют бактериальному зазору, и последовательно изолировать их. Однако, гемоциты в других частях тела и гемолимфом также важны для зазора. Хотя мы не изучали эту популяцию клеток, наша общая процедура может быть применима и для фагоцитных анализов этих клеток. Одним из преимуществ нашего подхода является то, что мы можем количественно фагоцитных событий в отдельных гемоцитов, что позволяет нам обнаружить тонкие изменения в фагоцитных процессов. Другие исследования, которые визуализировать флуоресцентные события через кутикулу18,19 не учитывают различия в количестве гемоцитов настоящее время, что особенно важно рассмотреть в нашем случае, как общее количество гемоцитов, как ожидается, изменится свозрастом 17.
Protocol
1. Собирать и стареть дрозофилы
- Для генерации же в возрасте F1 мух для тестирования фагоцитоза, добавить 5-10 девственных женщин и 5 мужчин соответствующих генотипов на флакон, содержащий свежие продукты питания мухи. Мы используем кукурузную мелиору агар на основе пищи20, но метод должен работать независимо от типа диеты мухи выращиваются на. Для этого эксперимента мы использовали Hemese (Он)-GAL4; UAS-GFP летит, чтобы пометить гемоциты генетически.
ПРИМЕЧАНИЕ: Больше мух могут быть использованы, но некоторые линии D. melanogaster не может спариваться или размножаться хорошо, когда переполненность, и переполненность может иметь неблагоприятные последствия для развития личинок21 и фагоцитоз. - Поддерживайте мухи в желаемых экспериментальных условиях. Для этого эксперимента, поддерживать He-GAL4; UAS-GFP летает при 24 градусах Цельсия. Разрешить взрослым мух спариваться в течение недели, а затем удалить взрослых. F1 мухи будут собраны из этих флаконов после экзпиона для экспериментального использования.
- Собирайте девственных мух в течение недели, или до тех пор, пока не будет собрано нужное количество мух. Девственницы не требуются; однако спаривание может повлиять на иммунный ответ. Если F1 мухи должны быть проверены как девственницы, отдельные мужчины и женщины в течение 8 часов после эквразиона и поддерживать в отдельных флаконах для предотвращения спаривания. Соберите достаточно мух, чтобы позволить оценку фагоцитоза, по крайней мере 10 мух на генотип / лечение / пол в возрасте.
- Если старение летит до одной недели, собрать по крайней мере 50 мух в общей сложности, или 20 мух в состоянии лечения для каждой частицы, либо фтор-частицы или рН чувствительных частиц, которые должны быть введены. Это обеспечит как минимум 10 мух для анализа во время эксперимента.
- Если старение летит более чем на 3 недели, собрать по крайней мере 100-150 мух в общей сложности, или 50-75 мух на лечение условие, чтобы обеспечить Есть достаточно мух для измерения фагоцитоза. Когда старение летит в лаборатории, мы обычно используем клетки насекомых поддерживается на 24 градусов по Цельсию в 12:12 L:D условия, и изменить пищу через день. Если флаконы используются вместо клеток, кончик летит в новые флаконы каждые 3-5 дней, в зависимости от состояния пищи во флаконе. Количество необходимых мух будет зависеть от того, как в конце возраста будет анализироваться фагоцитоз, и возрастных показателей выживаемости этого генотипа в определенном экологическом состоянии.
- Если молодые и пожилые мухи будут оценены, план соответственно так, что 1-недельный и пожилой мух будет введен в тот же день. Это позволит свести к минимуму различия в концентрации частиц между экспериментами и обеспечит, чтобы влияние возраста на фагоцитическое измерение не было смешано с эффектом дня проведения анализа.
- Дом собранных мух при 24 кк, пока они не 5-7 дней, или поддерживать мух до нужного возраста.
2. Подготовка флуоресцентно помеченных частиц
- Восстановление тепло-убитых E. coli фтор-частиц или рН чувствительных частиц кишечной палочки к концентрации запасов 20 мг / мл или 1 мг / мл, соответственно. Другие бактерии доступны для использования, которые могут быть более подходящими для некоторых экспериментов, но ссылаются на инструкции производителя для соответствующих концентраций запасов.
- Для фтор-частиц добавьте 990 мл 1x PBS (рН 7,4) или предпочтительный буфер и 10 мл 2 мл (20%) натрия азид. Вихрь для смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Азид натрия является консервантом, который может быть опущен; однако частицы, приготовленные без азида натрия, не длятся так долго. Фтор-частицы должны быть использованы в течение 24 часов и рН чувствительных частиц должны быть использованы в течение 7 дней. - Для чувствительных частиц рН добавьте 1 980 л 1x PBS (рН 7,4) или предпочтительный буфер и 20 мл 2 мл (20%) натрия азид. Вихрь для смешивания.
- Сделайте несколько одноразовых 20 аликотов в 1,5 мл микроцентрифуговых труб. Храните фтор-частицы при -20 градусов по Цельсию до года, а чувствительные частицы рН при 4 градусах Цельсия в течение 6 месяцев, защищенные от света.
- Для фтор-частиц добавьте 990 мл 1x PBS (рН 7,4) или предпочтительный буфер и 10 мл 2 мл (20%) натрия азид. Вихрь для смешивания.
- В день инъекций перед употреблением удалите азид натрия из частиц. Для этого центрифужирует частицы в течение 5 минут при температуре 15 000 х г.
- Удалите супернатант и мыть частицы дважды путем повторного регустроя в 50 мл 1x PBS или предпочтительного буфера, и центрифуги в течение 5 минут при 15000 х г.
- После второй стирки удалите супернатант и повторно активированные частицы в 100 мл 1x PBS или предпочтительный буфер. Держите раствор в трубке и свести к минимуму воздействие света на протяжении всего эксперимента. После удаления азида натрия используйте фтор-частицы в пределах 24 ч и используйте чувствительные частицы рН, используемые в течение 5-7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: В наших предыдущих экспериментах, мы обнаружили, что эта концентрация частиц при условии, подсчитанное количество фагоцитных событий и что количество частиц, доступных для фагоцитоза гемоцитов не ограничивает17. Тем не менее, пользователи этого протокола могут захотеть сравнить результаты с использованием других концентраций, чтобы убедиться, что существует достаточное количество частиц, доступных для фагоцитоза гемоцитов в условиях их экспериментов.- Если азид натрия был опущен, разбавить частицы 1:5 в том же буфере, с помощью которого были подготовлены частицы, для инъекций.
- Добавьте к частицам каплю (10 мл) зеленого пищевого красителя. Это упрощает работу мух.
3. Введите мух
- Подготовка стеклянных игл для инъекций.
- Вытяните стеклянные иглы с помощью пипетки шкив. Установите пипетки шкив нагреватель до 55 градусов по Цельсию и соленоид до 45. Используйте только иглы, предоставляемые инжектором, так как не гарантируется, что другие иглы будут работать с такой же точностью.
- Заполните стерильный шприц 1 мЛ с минеральным маслом, и прикрепите 30 калибровочных подкожных (G) иглы, предоставляемые с нано-инжектором.
- Backfill вытащил капиллярной иглы, вставив 30 G иглы в тупой конец вытащил стеклянной иглы и заполнить с минеральным маслом. Медленно удалите 30 G иглы, гарантируя Есть нет пузырьков воздуха по всей иглы, так как это может привести к неточным объемам инъекций. Инжектор не будет работать должным образом без заполнения иглы.
- Используя щипцы, разорвать кончик иглы, чтобы создать отверстие, чтобы выброс раствора.
- Соберите нано-инжектор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие инжекторы могут быть использованы. Метод, описанный ниже, применяется к нано-инжектору. Для других инжекторов, обратитесь к руководству пользователя для инструкций.- Установите инжектор к нужному объему (между 46 nL и 69 nL).
- Удалите collet и поместите уплотнение O-кольца, белый прокладка с отступом лицом вверх, чтобы получить задний конец иглы, и больше O-кольцо на металлический поршень, в этом порядке. Прикрепить collet без затягивать его.
- Вставьте металлический поршень в тупой конец заполненной маслом стеклянной иглы. Аккуратно нажмите иглу вниз, вставив его в большую O-кольцо. Затяните collet до безопасного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если металлический поршень не простирается мимо коллеги, нажмите и удерживайте 'EMPTY' до тех поршень видна. Это облегчает обеспечение поршень вставляется в иглу. - Нажмите и удерживайте 'EMPTY' до тех пор, пока инжектор не пойдит звуковой сигнал. Это выбрасывает большую часть минерального масла из иглы, оставляя небольшой объем масла, чтобы выступать в качестве барьера между двумя жидкостями, а также удаляет пузырьки воздуха.
- Заполните иглу либо фтор-частицами, либо чувствительными частицами рН, вставив кончик стеклянной иглы в трубку микроцентрифуги, содержащую подготовленные частицы.
- Нажмите и удерживайте 'FILL' до тех пор, пока инжектор не пойдит звуковой сигнал.
- Инъекции
- Передача мух, которые должны быть введены в пустой флакон. Иммобилизируйте мух, поместив флакон во льду. CO2 также может быть использован для обездвиживания мух. Однако, обратите внимание, что при использовании рН чувствительных частиц, повышенные уровни CO2 может искусственно подкислять любые буферы, используемые и может поднять фоновую флуоресценцию.
- Введите мух в стерноплеуральной пластины грудной клетки(рисунок 1A). Инъекция является успешным, если зеленый краситель рассматривается вдаваясь в летать (Рисунок 1B). Если муха не зеленеет, убедитесь, что игла не засоряется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, мухи могут быть введены в живот, но держать место инъекции последовательной во всех экспериментах. - Место вводили мухи в новый пищевой флакон, отмечая время, что первая и последняя муха была введена. Чтобы свести к минимуму экспериментальную ошибку из-за количества времени, необходимого для завершения инъекций, завершить инъекции своевременно. На практике, это должно занять не более 10 минут, чтобы ввести один набор мух. Положите флакон на бок, пока все мухи не оправились, чтобы предотвратить мухи от застрять в пище.
- Разрешить мухам восстанавливаться в течение 60-90 мин, в зависимости от экспериментальных условий. Здесь было использовано 60-минутное время восстановления. Обратите внимание, что этот диапазон времени восстановления был оптимальным для подсчета фагоцитных событий в экспериментальных условиях в Horn et al. study17. Однако, при некоторых условиях, это может быть слишком долго, чтобы обнаружить тонкие различия в фагоцитозе между группами лечения. Возможно, было бы полезно провести эксперименты на времени, как это было сделано ранее17, чтобы определить время восстановления, которое покажет максимальные различия между контролем и экспериментальными результатами. Независимо от времени восстановления выбран, держать это последовательно во всех экспериментальных методов лечения.
- При инъекциях с фтор-частицами и рН чувствительных частиц в тот же день, используйте новую иглу для каждого раствора. Не впрыскивайте отдельных мух с обеими частицами, если они оба флуоресцируют красный, так как результат не будет различать два аспекта фагоцитоза, связывания частиц / поглощения против включения частиц в фагосоме.
4. Рассекирование спинного сосуда
- После того, как мухи восстановились за 60-90 мин, перенесите всех живых мух на пустой флакон и обездвижите на льду.
- Перенесите одну муху за один раз на силиконовую пластину вскрытия эластомера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка вскрытия пластин по крайней мере 1-недельный до использования, если лечение при комнатной температуре. Для этого приготовьте эластомер и вылейте его в 33 мм х 10 мм чашку Петри, заполнив блюдо примерно на полпути. Аккуратно коснитесь блюда на плоской поверхности, чтобы свести к минимуму пузырьки воздуха. Пусть тарелки сидят при комнатной температуре, спокойно, по крайней мере неделю.- Под рассекающим стерео микроскопом, ориентируйте муху вентральной стороной вверх.
- Использование насекомых булавки, контактный летать на тарелку, вставив один штифт через грудную клетку, а другой контактный через самый задний конец живота, вблизи гениталий (Рисунок 2A). Это может быть полезно, чтобы сократить булавки пополам, прежде чем прижимая образец, чтобы не препятствовать вскрытию. Повторите с до 10 мух на вскрытии пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно: Удалите крылья и ноги, прежде чем прижимая летать к пластине. Это поможет предотвратить пузырь, образующийся вокруг мухи, когда средства массовой информации добавляется. - После того, как все мухи были прижаты к пластине, добавьте достаточно средств вскрытия, чтобы покрыть мух (1 мЛ) с помощью передачи pipet.
- Используя щипцы или ножницы кутикулы, снимите голову.
- Используя ножницы кутикулы, сделайте два горизонтальных разреза: один прямо над задней булавкой в животе, а другой на самом передней части живота, где грудной клетки и живота встречаются (Рисунок 2B, C). На рисунке 2,голова была оставлена нетронутой для уточнения ориентации.
- Сделайте вертикальный разрез, соединив два горизонтальных разреза (три разреза напоминают букву I). Это откроет брюшную полость(Рисунок 2D).
- Используя щипцы, удалить внутренние органы и ткани, избегая спинного сосуда. Если не беспокоит, прозрачный спинной сосуд часто можно увидеть пульсирующий вблизи переднего конца живота. Дополнительные булавки могут быть использованы для контактный открыть вновь сократить концы кутикулы (Рисунок 2E, F).
- Используя ножницы кутикулы, удалите грудную клетку. Кроме того, грудная клетка может быть удалена перед монтажом расчлененных кутикул и спинных сосудов на слайде микроскопа.
- Повторите с оставшимися мухами. препарировать мух своевременно, чтобы свести к минимуму возможные колебания в фагоцитии скорости. После того, как все мухи были вскрыты, оставьте кутикулы с прикрепленным спинным сосудом, прижатым к пластине. Весь шаг 5 будет осуществляться в вскрытии пластины. Это предотвратит повреждение или случайное отбрасывание кутикулы между ступенями.
5. Фиксация и окрашивание
- Исправить расчлененные кутикулы с прикрепленным спинным сосудом в 4% параформальдегиде (ПФА).
- Используя новый одноразовый трансфер для каждого шага, откажитесь от средств вскрытия и замените 1 мл 4% PFA. На протяжении фиксации и окрашивания, держать вскрытия защищены от света как можно больше.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин с качания при 20 об/мин. Не позволяйте вскрытия сидеть в фиксатор более 20 минут, так как это может начать повредить ткани.
- Вымойте кутикулы 2x в 1x PBS - 0,1% Tween (PBST).
- Удалить фиксатор и заменить 1 мл 1x PBST.
- Вымойте при комнатной температуре в течение 15 мин с качания.
- Повторите 1x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчлененная, фиксированная ткань может храниться при 4 градусах Цельсия, в течение 3 дней, защищенных от света, после первой стирки, заменив стирку свежим PBST. Не храните фиксированные ткани, если антитела будут использоваться. Антитела следует использовать со свежей тканью для достижения наилучших результатов.
- Дополнительно: окрашивание антител. Антитела могут быть использованы для четкого визуализации спинной сосуд четко (Рисунок 3), или для обнаружения гемоцитов конкретных маркеров. Это может обеспечить только клетки вдоль спинного сосуда подсчитываются или пометить мембрану гемоцитов.
- Удалить вторую стирку, добавить первичные антитела при соответствующем разбавлении. Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию, с качания.
- Удалить первичные антитела, и мыть дважды с PBST в течение 15 мин с качания.
- Добавьте флуоресцентное вторичное антитело. Мы рекомендуем зелено-флуоресцентное антитело, чтобы оно не заслонять флуоресцентные частицы. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч, с качалкой.
- Удалить вторичные антитела, мыть дважды в течение 15 минут каждый с PBST.
- Пятно с DAPI.
- Удалите окончательную стирку и замените 1 мЛ DAPI, разбавленного в PBST (1:1000).
- Пятно в течение 20 мин с качания при комнатной температуре.
- Удалить DAPI и промыть 2x (повторите шаг 5.2).
- Замените финальную стирку на свежую 1x PBST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи могут храниться при 4 градусах Цельсия, в течение 3 дней, защищенных от света, после первой стирки, заменив стирку свежим PBST.
6. Монтаж кутикулы на слайдах микроскопа и изображения
- Приготовьте расчлененные кутикулы.
- Под рассекающим стереомикроскопом отрежьте избыток кутикулы, которая может помешать визуализации.
- Используя щипцы, перенесите кутикулы с прикрепленным спинным сосудом в микроцентрифугную трубку 1,5 мл, содержащую 70% глицерол. Размещение кутикулы в глицерол поможет удалить PBST и позволяет более четкое изображение во время визуализации.
- Гора кутикулы на слайд микроскопа.
- Добавьте несколько капель 70% глицерола в слайд микроскопа.
- Используя щипцы, удалить кутикулы из глицерол трубки и место в глицерол на слайде.
- Под рассекающим стерео микроскопом используйте щипцы для ориентации кутикулы брюшной стороны вверх, обеспечивая видна спинная сосуд. Темный пигмент кутикулы будет лицом вниз.
- Добавить дополнительную каплю глицерол, если это необходимо. Это помогает предотвратить пузырьки воздуха и позволяет более четкое изображение.
- Аккуратно поместите крышку над кутикулами и краями уплотнения с лаком для ногтей. Дайте высохнуть в течение 10-15 мин, прежде чем продолжить. Изображение мух немедленно или хранить в светонепроницаемой коробке при 4 градусов по Цельсию.
- Изображение спинного сосуда.
- Используя флуоресцентный микроскоп, используйте систему структурных помех для генерации оптических секций спинного сосуда. В качестве альтернативы можно использовать конфокальный микроскоп, который может обеспечить дополнительную точность. Получите изображения спинного сосуда с помощью 20-х объективного и предпочтительного программного обеспечения для визуализации. Добавьте 10-мм бар масштаба, и правильно этикетки и сохранить изображения, как tiff файлов(Рисунок 4)или желаемого формата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество полученных изображений с стеком может варьироваться между вскрытиями и зависит от того, насколько хорошо был рассечен спинной сосуд, и от желаемого размера шага между изображениями. Здесь размер шага был установлен до 0,49 мм. Это число может варьироваться от 3 до 40 изображений на стек в нашем опыте.
- Используя флуоресцентный микроскоп, используйте систему структурных помех для генерации оптических секций спинного сосуда. В качестве альтернативы можно использовать конфокальный микроскоп, который может обеспечить дополнительную точность. Получите изображения спинного сосуда с помощью 20-х объективного и предпочтительного программного обеспечения для визуализации. Добавьте 10-мм бар масштаба, и правильно этикетки и сохранить изображения, как tiff файлов(Рисунок 4)или желаемого формата.
7. Анализ изображений
- Количественная оценка флуоресцентных событий с помощью ImageJ.
- Открыть изображения и сложить их: Изображение - Стеки - Изображения в стек.
- Подсчитайте только флуоресцентные сигналы размером 1 мм в пределах 10 мм, сосредоточенные на DAPI-позитивном ядре, нажав на каждое событие, по крайней мере, от 10 клеток на муху, от по крайней мере 10 мух на место ввода частицы: Плагины и анализ à и cell Counter Notice (Рисунок 5A). Инструмент счетчика ячейки присваивает другой цвет каждой отслеживаемой ячейке, с цветной точкой, которая соответствует каждому флуоресцентному событию, нажатому в этой ячейке.
- Чтобы перечислить позицию счетчика и стека, связанную с каждой точкой, нажмите 'm' или выберите меру под вкладкой «Анализ» или для отображения количества событий, подсчитанных в каждой ячейке в таблице результатов, нажмите «alt qy»(рисунок 5B).
- Передача ячейки рассчитывается в электронную таблицу, которая будет использоваться для статистического анализа.
- Выполните статистический анализ.
- Проанализируйте различия в фагоцитных событиях с помощью либо фиксированных эффектов ANOVA, либо смешанной модели nested ANOVA. Смешанные модели могут быть использованы для проверки основных фиксированных эффектов возраста и генотипа и случайного эффекта лиц, вложенных в каждый генотип17.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следователи должны быть строгими в тестировании предположения любой статистической процедуры, используемой для анализа данных.
- Проанализируйте различия в фагоцитных событиях с помощью либо фиксированных эффектов ANOVA, либо смешанной модели nested ANOVA. Смешанные модели могут быть использованы для проверки основных фиксированных эффектов возраста и генотипа и случайного эффекта лиц, вложенных в каждый генотип17.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать описанные методы инъекции, Рисунок 1A показывает место инъекции на Drosophila melanogaster, а также как пищевой краситель позволяет визуальное подтверждение того, что муха была введена (Рисунок 1B). Добавление пищевого красителя также помогает в распознавании засоренных иглы. Инъекции могут быть выполнены в брюшной полости, но держать место инъекции последовательной через эксперименты. Это поможет свести к минимуму возможные различия между каждым экспериментом.
Чтобы визуализировать флуоресцентно помеченные частицы в пределах ординаторных гемоцитов вдоль спинного сосуда, мы вскрыли спинной сосуд и прикрепили брюшную кутикулу. На рисунке 2A-F излагаются методы вскрытия.
Для оценки возрастной способности молодых и престарелых мух проводить фагоцитоз, гемоциты вдоль спинного сосуда визуализируются с помощью флуоресцентного микроскопа. Для обеспечения того, чтобы только клетки вдоль спинной сосуда подсчитываются, антитела или GFP-тегами генов для определенных маркеров клеток крови или сердца конкретных коллагена, таких как гемес и гемолектин, или Pericardin (Рисунок 3), соответственно, могут быть использованы22,23,24. Флуоресцентно помеченные частицы кишечной палочки имеют 1 мм в длину, в то время как гемоциты 10 мм вдиаметре 17. Подсчитываются только те флуоресцентные события, расположенные в диаметре 10 мм, сосредоточенном на DAPI-положительном ядре(рисунок 4). Для количественной оценки флуоресцентных событий используется программное обеспечение ImageJ(рисунок 5).
Рисунок 1: Сайт инъекций и визуальная проверка. (A) Боковая сторона грудной клетки прокалытается вытянутой капиллярной иглой. (B) Инъекции визуально проверены путем добавления зеленого пищевого красителя к раствору частицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Вскрытие спинного сосуда. (A) Пины помещаются в грудную клетку и задний живот (черные стрелки). (B-C) Два горизонтальных разреза (зеленые стрелки) делаются на заднем конце живота(B),и передний конец (C). (D) Вертикальный разрез (зеленая стрелка) производится посередине живота, соединяя два горизонтальных разреза. (E) Дополнительные булавки (я) используются для филе открыть брюшной полости, подвергая внутренней ткани. (F) Внутренняя ткань (урожай, кишечник, матка, яичники, жировые тела) удаляется, подвергая спинной сосуд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Венральный вид расчлененного спинного сосуда от 5-недельной самки, впрыскиваемой рН чувствительными частицами, окрашенными антителами, направленными против Перикардина (A). Пунктирная белая линия очерчивает боковую сторону спинного сосуда со стрелкой, указывающей на переднюю область. (B) Увеличенное изображение (A): кластеры гемоцитов (голубая стрелка), которые активно деградирует бактерии, в первой аортальной камере спинного сосуда. (C) Увеличенное изображение (A) с изложением внеклеточной матрицы (ECM) коллагеноподобный белок, Перикарин (зеленая стрелка), который держит спинной сосуд на месте24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Расчлененный спинной сосуд и связанные с ними гемоциты из самки мухи, вводимые с чувствительностью к рН частиц, или фтор-частиц. ()Спинной сосуд и связанные с ним гемоциты с поглощенным рН чувствительных помечены E. частицы кишечной палочки (красный), или (E) фтор-маркированные частицы кишечной палочки (красный), изолированные от 1-недельной мухи, после восстановления в течение 60 мин. (B, F) Увеличенный вставка (A) и (E) (белый ящик), соответственно, показывая два отдельных гемоцитов с подсчетом. (C) Спинной сосуд и связанные с ним гемоциты с поглощенным рН чувствительных помечены частицы кишечной палочки (красный), или ( G) фтор-маркированные частицы кишечной палочки (красный), изолированные от 5-недельной мухи, после восстановления в течение 60 мин. (D, H) Увеличенный вставка (C) и (G) (белый ящик), соответственно, показывая два отдельных гемоцитов с количеством случаев. Пунктирная белая линия очерчивает боковую сторону спинного сосуда со стрелкой, указывающей на переднюю область. Ядра, окрашенные DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Количественная фагоцитарный событий в 10 мм гемоцитов с помощью счетчика клеток в ImageJ. (A) После открытия изображения (ы) в ImageJ, сотовый счетчик Уведомление инструмент может быть использован для отслеживания фагоцитных событий на клетку. (B) Этот инструмент назначит другой цвет каждой ячейке, выбранной для подсчета, с каждой точкой, соответствующей флуоресцентному событию в этойячейке. Нажатие на "alt'y" будет отображать таблицу, показывающую количество событий, подсчитанных в ячейке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Протокол, описанный здесь, является надежным способом количественной оценки различных аспектов фагоцитоза, в контролируемых экспериментальных условиях. Мы отмечаем, что мы только протестировали эту процедуру с грамположительными бактериальными частицами и результаты могут отличаться, если грамм положительные бактериальные частицы используются. Действительно, было бы интересно сравнить фагоцитные реакции как на грамоты отрицательных и грамм положительных бактерий в различных экспериментальных условиях. Использование нано-инжектора позволяет точно контролировать объемы инъекций, обеспечивая впрыскивание каждой мухи с одинаковым объемом частиц. Одно ограничение протокола связано с несоответствиями в подготовке частиц. Частицы будут агрегироваться после замораживания, поэтому небольшие колебания объемов разбавления или отсутствие вихря могут повлиять на концентрацию частиц между экспериментами. Чтобы свести к минимуму возможные колебания концентрации частиц в разных возрастных группах, полезно вводить мух 1- и 5-недельного возраста в один и тот же день, используя тот же иглы и раствор частиц. Другим потенциальным недостатком является то, что во время вскрытия, спинной сосуд и / или кутикулы могут быть легко повреждены, если булавки не обрабатываются должным образом. Чтобы избежать нарушения спинной сосуд, свести к минимуму количество булавок, используемых в вскрытии. Преимущество этого метода вскрытия заключается в том, что все фиксации, стирки и окрашивания шаги могут быть выполнены в вскрытии пластины. Поскольку кутикулы закреплены вниз, это предотвращает кутикулы от потери между шагами.
По сравнению с существующими методами18,,19,,25,,26,,27,,28,,29,описанный протокол имеет свои преимущества и ограничения. Рассекав спинной сосуд, мы можем визуализировать и количественно определить индивидуальные гемоциты в этом месте. Это позволяет обнаруживать тонкие вариации в фагоцитной активности между экспериментальными группами. Другие методы визуализировать флуоресцентно помечены частиц, собирая гемоциты с помощью анализа Кровотечения / Scrape19,25,26,,27, или через нетронутыми брюшной кутикулы18,19,28,29; однако, отдельные гемоциты не могут быть оценены при визуализации через спинной кутикулы. Преимущество этого протокола, по сравнению с методом Bleed/Scrape, заключается в том, что наш метод позволяет нам оценить только те гемоциты, связанные с спинным сосудом, и учитывает циркулирующие клетки или те, которые расположены вдоль стенки тела, которые могут быть функционально разными. Рассекречивание спинного сосуда также устраняет необходимость включения второго раунда инъекций с флуоресценцией quencher, как Трипан синий19,26. Это потому, что любые частицы, не связанные или поглощенные клеткой, будут смыты во время шагов мытья. И наоборот, альтернативные методы могут быть проще в выполнении, поскольку они не требуют вскрытия. Хотя вскрытие спинного сосуда легко узнать, этот шаг добавляет уровень сложности, которые не могут быть осуществимы в некоторых экспериментальных конструкций.
Хотя описанное использование этого in vivo фагоцитоза анализ для оценки и количественной фагоцитных событий между различными возрастами, этот протокол является весьма адаптируемым и может быть использован для анализа различных аспектов фагоцитоза между генотипом, полом или типом ткани. С фагоцитозом, имеющих центральное значение для большинства многоклеточных животных, понимание того, как этот процесс снижается с возрастом может привести к улучшению терапевтического лечения для стареющего населения. Этот подход предлагает долгосрочный потенциал для выяснения аспектов возрастных изменений иммунного ответа, с особым акцентом на фагоцитоз.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национальных институтов здравоохранения R03 AG061484-02 и UMBC колледж естественных и математических наук Бектон Дикинсон факультет исследовательский фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
- Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
- DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. Immunity and aging: the enemy within. Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).
- Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J.
- Panda, A., et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).
- Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).
- Min, K. -J., Tatar, M. Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472 (2018).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. Drosophila as a genetic model for hematopoiesis. Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Garschall, K., Flatt, T. The interplay between immunity and aging in Drosophila. F1000Research. 7, (2018).
- Brennan, C. A., Anderson, K. V. Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response. Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: a fundamental process in immunity. BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).
- Stuart, L., et al. A systems biology analysis of the Drosophila phagosome. Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).
- Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html (2019).
- Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Goto, A., et al. A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor. Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).
- Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart. Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).
- Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection. Wellcome Open Research. 3, (2018).
- Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Gyoergy, A., et al. Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).
- Bosch, P. S., et al. Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia. BioRxiv. 578864, (2019).
