Summary
يصف هذا البروتوكول نهج التهجين في الموقع الفعال للكشف عن مستويات التعبير mRNA والأنماط المكانية للجينات المستهدفة في السائل الكوليسي.
Abstract
التهجين في الموقع (ISH) هو تقنية مفيدة للغاية لتقديم أنماط التوزيع الخلوي لجينات محددة (على سبيل المثال، مرنا وncRNA) في الأنسجة. دودة sipunculid Sipunculus nudus هو مورد مصائد الأسماك الحاسمة كما أن لديها قيم غذائية وطبية عالية. حاليا ، فإن البحوث على البيولوجيا الجزيئية من Nudus Sipunculus لا تزال في مهدها. الغرض من هذه المقالة هو تطوير طريقة حساسة لتوطين مرنا محددة في السائل الكوليسي سيبونكولوس. يتضمن البروتوكول خطوات مفصلة من ISH ، بما في ذلك antisense المسمى digoxigenin وإعداد الريبوسبر بالإحساس ، وجمع السوائل الكيوموإعداد القسم ، وتهجين الريبوسوم المحدد ، واحتضان الأجسام المضادة ، والتلوين وعلاجات ما بعد التلوين. يتم عرض النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تجربة ناجحة باستخدام هذه الطريقة. وينبغي أن ينطبق البروتوكول على أنواع سيفونكولا الأخرى أيضا.
Introduction
ISH، وذلك باستخدام مسبار الحمض النووي المسمى للكشف عن الحمض النووي محددة أو تسلسل الحمض النووي الريبي من الفائدة، هو وسيلة مفيدة لوصف نمط التعبير المكاني للجينات المستهدفة في الأنسجة المحفوظة شكليا1،2،3. عادة ، يتم إنشاء تسلسل الهدف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ثم يستخدم كقالب لتوليف مسبار الحمض النووي الريبي المضاد / الإحساس المسمى بيوريدين-5-ثلاثي الفوسفات digoxigenin. يتم إصلاح العينات وpermeabilized قبل الحضانة مع الريبوسبر. بعد غسل قبالة التحقيق الزائد، يتم تصور التهجين من قبل الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة للأكسجين، وهو القلوية فوسفاتاز مترافق3،,4،,5،,6.
Sipunculus nudus (فيلوم سيبوناولا؛ النظام Sipunculida: Sipunculidae) هو دودة بحرية غير مجزأة، coelomate ومتناظرة ثنائيا7،8. Sipunculus nudus هو نوع عالمي موزعة على نطاق واسع في المياه الساحلية الاستوائية والمعتدلة. كما أنها مورد صيد بحري مهم في جنوب الصين بسبب قيمها الغذائية والطبية العالية9،10. ومع ذلك ، فإن Sipunculus nudus في البيولوجيا الجزيئية لا يزال في مراحله الأولى. لفهم الدور البيولوجي للجينات بشكل كامل ، فإن التحقيق في أنماط تعبير الجينات في قرار خلوي هو أمر مهم بشكل كبير. في الكائن غير النموذجي Sipunculus nudus، لم يتم بعد إنشاء طريقة ISH ، وهي طريقة مثالية للكشف عن أنماط تعبير الجينات. يحتوي السائل الكائي على عدة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، وخلايا الجر ، والخلايا العمودية ، والخلايا الجرثومية ، والكريات الحمراء ، وما إلى ذلك11. الجنس المزدوج / ماب-3 عامل النسخ ذات الصلة-1(dmrt1),تستخدم كجين تمثيلي في هذه الطريقة, هو منظم النسخ المحفوظة للغاية من تحديد الجنس والتمايز في معظم الأنواع التي تتراوح بين اللافقاريات إلى الثدييات12,,13. في مجموعة من الأنواع (أي الإباحية السوداء، وما إلى ذلك) 14, تم التعبير عن dmrt1 في خلايا سيرتولي, المحيطة الخلايا الانباتية, وظيفتها مماثلة لخلايا التروبهوبلاس سبونكولوس. لذلك ، افترضنا أن dmrt1 من Sipunculus nudus يتم التعبير عنه في الخلايا الغذائية من الحيوانات المنوية ، ونتيجة لطريقة ISH أكدت بوضوح الفرضية.
يصف هذا البروتوكول لأول مرة ISH ، مع تحقيقات antisense/sense ssense /sense ssense ، لتحديد أنماط تعبير مرنا في مسحة السائل الكوافي. يتم توفير ظروف التفاعل الأمثل ، والتي تسمح بتصور حساس للغاية للتعبير مرنا بدقة عالية. يمكن تطبيق طريقة ISH المطورة في أنواع سيباونكوليدا أكثر من Sipunculus nudus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان ورعاية الحيوان بجامعة هواتشياو على اجراء الحيوان .
1. ريبوسوبر التحضير
- تصميم التمهيدي
- افتح برنامج التمهيدي 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). نسخ تسلسل dmrt1 (GenBank: MK182259) في إطار التسلسل.
- تعيين طول التمهيدي (23-25 نقطة في الثانية)، درجة حرارة الذوبان (55-60 درجة مئوية)، ومحتوى G/C (40-60٪). انقر فوق اختيار التمهيديات.
ملاحظة: الحد الأدنى من الحجم المطلوب للتحقيق الحمض النووي الريبي هو حوالي 500 bp. تحقيقات أطول عادة ما يكون أعلى خصوصية. - إضافة T7 RNA البوليميراز مروّز تسلسل (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3, ) إلى واحدة من التمهيديات المختارة., يتم عرض تسلسل التمهيدي dmrt1 لـ ISH في الجدول 1.
ملاحظة: للحصول على تحقيقات الإحساس، يقع T7 RNA polymerase المروج في نهاية 5 'من التمهيديات إلى الأمام. للتحقيقات antisense، يقع T7 RNA polymerase المروج في نهاية 5'-من التمهيديات العكسي.
- تضخيم PCR
- ضع أنابيب الميكروفوج على الجليد، وأعد مزيج التفاعل التالي (لرد فعل 50 ميكرولتر): 1x مزيج البوليميراز الحمض النووي للقواق، 1 ميكروغرام من cDNA (الذي يتم إعداده من 100 ميكرولتر من السائل الكيوم)، 1 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 1 ميكرومتر التمهيدي العكسي والمياه الخالية من nuclease.
- خلط تفاعل PCR عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة.
- ضع أنبوب التفاعل في الدورالحراري الحراري ، وقم بتشغيل PCR باستخدام الشروط التالية: التسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين تليها 36 دورة من التنحني عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ق ، والظهر عند 55-60 درجة مئوية لمدة 30 ق ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ق والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقيقة.
ملاحظة: يجب تحسين درجة حرارة الصلب وفقًا للالتمهيديات.
- تنقية منتجات PCR والتحقق من صحتها
- قم بتحميل 50 ميكرولتر من خليط PCR مباشرة على جل أغاروز 1٪. تشغيل هلام agarose في 150-180 V لمدة 10 دقيقة في 0.5x TBE. عزل شظايا الحمض النووي محددة من هلام أغاروز 1٪.
ملاحظة: يجب أن يظهر الحمض النووي كشريط واحد وليس كمسحة. - تنقية شظايا الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قياس المنتجات النقية عن طريق قياس الطيف الضوئي على طول موجة من 260 نانومتر.
- التحقق من صحة منتجات PCR عن طريق التسلسل.
ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) يمكن تخزين منتجات PCR المنقى عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
- قم بتحميل 50 ميكرولتر من خليط PCR مباشرة على جل أغاروز 1٪. تشغيل هلام agarose في 150-180 V لمدة 10 دقيقة في 0.5x TBE. عزل شظايا الحمض النووي محددة من هلام أغاروز 1٪.
- تخليق الريبوسبر
- ضع أنابيب الميكروميج الخالية من RNase على الجليد ، وأضف ما يلي إلى أنبوب الميكروفوج (لرد فعل 10 ميكرون): 1x Digoxygenin RNA الوسم ميكس ، 1x النسخ الاحتياطي ، 0.5 ميكرولتر من مثبطات RNase ، 1 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي الريبي T7 ، 1 ميكروغرام من منتج PCR والماء الخالي من RNase. خلط رد الفعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
- إضافة 2 μL من DNase خالية من DNase I. مزيج التفاعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- إضافة 2 μL 0.2 M EDTA (درجة الحموضة 8.0). خلط رد الفعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة.
- أضف 2.5 ميكرولتر من 4 M LiCl و 75 ميكرولتر من الإيثانول المبرد مسبقًا إلى رد الفعل المذكور أعلاه. تخلط جيدا. يترك لمدة 30 دقيقة عند -70 درجة مئوية.
- الطرد المركزي عند 12,000 × غرام لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ديكانت الإيثانول. أضف 1 مل من الإيثانول المبرد مسبقًا بنسبة 70٪ (v/v) واغسل هطول الأمطار عن طريق الاختلاط بلطف.
- الطرد المركزي عند 12,000 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. Decant الإيثانول 70٪ وتجفيف هطول الأمطار لفترة وجيزة بالقرب من مصباح الكحول. حل هطول الأمطار عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase وتخلط بلطف.
- تحميل 2 μL من الحمض النووي الريبي توليفها على هلام أغاروز 1٪. تشغيل هلام agarose في 180 V لمدة 5-10 دقيقة في 0.5x TBE. قياس تركيز الحمض النووي الريبي المسمى باستخدام مطياف على طول موجة من 260 نانومتر.
- استخدم أنابيب المايكروفوج الخالية من RNase ونصائح التصفية لتجنب تلوث RNase.
ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) يمكن تخزين المسابير المسماة بالديأكسجينين عند -70 درجة مئوية لعدة أشهر.
- استخدم أنابيب المايكروفوج الخالية من RNase ونصائح التصفية لتجنب تلوث RNase.
2- جمع السوائل الكيومية
- إصلاح nudus S. على الجدول تشريح مع دبابيس. فتح الجسم من النودوس S. مع مقص الأوتوكلاف الصغيرة. عزل السائل الكيوم مع ماصة.
- جمع ونقل 1 مل السائل الكل الكل مع ماصة إلى شرائح المجهر متعدد الأبعاد المعالجة. تطبيق السائل coelomic بالتساوي مع طرف ماصة. الهواء الجاف الشرائح لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
3- التهجين في الموقع
- اليوم الأول
- Rehydrate الشرائح في جرة تلطيخ الشريحة التي تحتوي على 100 مل من 1x ديثيل بيروكربونات معالجة الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (DEPC-PBS). Rehydrate 3 مرات مع 1x DEPC-PBS، 5 دقيقة لكل غسل مع الانفعالات لطيف.
- Permeabilize مسحة السائل الكوليسيوم عن طريق الهضم مع 10 ميكروغرام / مل بروتينات K في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة. احتضان الشرائح في 4٪ من البارافورمالديهايد (PFA) لمدة 20 دقيقة لوقف الهضم. غسل الشرائح في 1x DEPC-PBS مع الانفعالات لطيف لمدة 5 دقيقة 3 مرات.
- أضف 50 ميكرولتر من مزيج التهجين (HM) الذي يحتوي على مسبار الريبوز بالإحساس/التحسس المضاد على الشرائح وإضافة زلة غطاء.
- إضافة مربع الرطب المخزن المؤقت في المربع الرطب. وضع الشرائح في مربع الرطب وختم جيدا مع فيلم البارافين. تهجين بين عشية وضحاها (على الأقل 16 ساعة) في 60 درجة مئوية.
- اليوم الثاني
- سخني المخزن المؤقت للغسيل على حرارة 65 درجة مئوية. تزج الشريحة في جرة تلطيخ الشريحة التي تحتوي على المخزن المؤقت لغسل والسماح لها الوقوف حتى شرائح coverslip قبالة تلقائيا. يستغرق حوالي 5 دقيقة.
- اغسل مرتين بالسعة المؤقتة للغسيل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع تهيج لطيف. اغسل 2 مرات مع سترات المحلول ة المالحة والصوديوم (SSC) عند درجة حرارة 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. يغسل مرتين مع حمض ماليك العازلة التي تحتوي على Tween 20 (MABT) في درجة حرارة الغرفة، 30 دقيقة لكل غسل مع الانفعالات لطيف.
- احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 ساعة في المخزن المؤقت للحظر. احتضان الشرائح في 1 مل المضادة digoxigenin-AP فاب شظايا الشظايا المخفف في 1/5000 مع عازلة حظر في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- اليوم الثالث
- إزالة حل الأجسام المضادة وغسل الشرائح لفترة وجيزة في مابت. اغسل 4 مرات مع مابت في درجة حرارة الغرفة، 25 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.
- احتضان الشرائح مع العازلة فوسفاتاز القلوية في درجة حرارة الغرفة 3 مرات، 5 دقيقة لكل غسل. إزالة العازلة فوسفاتازي القلوية، وإضافة 1 مل من 5-برومو-4-الكلورو-3-indolyl الفوسفات (BCIP)/نيترو الأزرق رباعي التروسيوم (NBT) محلول تلطيخ. إبقاء الشرائح في الظلام.
- مراقبة رد فعل اللون بشكل دوري تحت المجهر البصري. عندما يتم تطوير اللون بالكامل (وقت رد الفعل في نطاق 1-4 ساعة)، اغسل الشرائح مرتين مع MABT في درجة حرارة الغرفة، 5 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.
- اغسل 2 مرة مع محلول التوقف في درجة حرارة الغرفة، 15 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. احتضان الشرائح في الميثانول لإزالة وصمة عار الزائدة، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وفقا للون الخلفية، يمكن أن يتم غسل الميثانول 2 أو 3 مرات ويمكن تمديد وقت إزالة اللون.
- اغسل 2 مرات مع مابت في درجة حرارة الغرفة، 5 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. نقل الشرائح إلى ورقة تصفية جديدة. إضافة 50 ميكرولتر من الجلسرين. إضافة coverslips ومراقبة مجهرية.
ملاحظة: يتم عرض تكوين الحل في الجدول 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد موجز للخطوات التي تنطوي عليها ISH في الشكل 1. تم تصنيع Antisense والريبوسبر اتى للdmrt1 من منتجات PCR تضخيمها من cDNAs السائل coelomic. وتم التحقق من صحة منتجات الـ PCR عن طريق التسلسل المباشر. تم تصنيع Riboprobes باستخدام تي 7 RNA البوليميراز وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة وتقرير سابق4 مع بعض التعديلات الطفيفة. وترد الإشارات التمثيلية لـ ISH في الشكل 2. ISH من السائل الكولودوس السبّالي مع الريبوسبر المضاد للمنطق الذي يستهدف dmrt1 يكشف تلطيخ الأرجواني تتركز في الخلايا التروبهوبلاسية من الحيوانات المنوية(الشكل 2A, B,السهام الحمراء). تم استخدام الريبوسبر بالإحساس كتحكم سلبي ، ولم يكتشف الريبوسبر الحاسة لـ dmrt1 أي إشارة تهجين(الشكل 2C).
الشكل 1 - ما إذا كانت هناك نسبة مخطط التدفق من ISH. صناديق زرقاء هي خطوات لتوليف riboprobe. المربعات الخضراء الخفيفة هي خطوات للإجراءات في الموقع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 - ما إذا كانت هناك نسبة التعبير عن dmrt1 في سيبونكولوس nudus السائل coelomic التي اكتشفتها ISH. (أ، ب) التهجين مع dmrt1 antisense riboprobe. (C)التهجين مع dmrt1 استشعار riboprobe. تمثل الأسهم الحمراء إشارات التهجين في الخلايا الغذائية. sz، الحيوانات المنويةzeugmata. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون15. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | تسلسل (5′-3′) |
| مكافحة التحقيق F | ACAATGTAGCAGGGTATCTTGG |
| مكافحة التحقيق R | TAATACGACTCATATATGTTTTTATATGCCCAGTAAA |
| الإحساس التحقيق F | TAATACGACTCATGAGAACAATTAGGGTTTAATCTTGG |
| الإحساس التحقيق R | CTGTTTTCTCTATCCACCAGTAA |
الجدول 1 - ما إذا كانت هناك تسلسل التمهيدي dmrt1.
| كاشف | تكوين |
| 5 × TBE (1 لتر) | 54 غرام من تريس، 27.5 غرام من حمض البوريك و 20 مل 0.5 M EDTA (درجة الحموضة 8.0). |
| 10 × برنامج تلفزيوني (5 لتر) | 400 غرام من NaCl، 10 غرام من KCl، 72 غرام من نا2HPO4 و 12 غرام من KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 L من 1 × PBS و 1 مل DEPC. |
| 4٪ PFA في 1 × PBS (100 مل، درجة الحموضة 7.4) | 4 غرام من PFA و 100 مل PBS. |
| 10 ملغ/مل بروتيني ك (1 مل) | 10 ملغ من بروتينات ك. |
| 20 × SSC (1 لتر) | 175.3 غرام من NaCl و 88.2 غرام من ملح حمض الستريك ثلاثي الصوديوم. |
| مربع الرطب المخزن المؤقت (50 مل) | 2.5 مل من 20 × SSC، 22.5 مل من المياه الحرة RNase و 25 مل من formionizedformamide. |
| مزيج التهجين (HM، 200 مل) | 100 مل من formined deionized، 50 مل من 20 × SSC، 10 ملغ من الهيبارين، 100 ملغ من الحمض النووي الرينا، 0.39 غرام من حمض الستريك، 200 ميكرولتر من Tween-20 وRNase المياه الحرة إلى 200 مل. |
| غسل المخزن المؤقت (1 L) | 50 مل من 20 × SSC، 500 مل من formionized formamide، 450 مل من الماء المعقم و 1 مل Tween-20. |
| مابت (1 لتر) | 11.6 غرام من حمض الرليك، 8.77 غرام من NaCl، 8.25 غرام من NaOH و 1 مل Tween-20. |
| حظر المخزن المؤقت | 1 × MABT، 2٪ مصل الأغنام (فول / فول) و 2 ملغ / مل BSA. |
| القلوية فوسفاتاز عازلة | 100 mM NaCl، 100 mM Tris HCl (درجة الحموضة 9.5)، 50 mM MgCl2،و 0.1٪ Tween 20 (vol/vol). |
| إيقاف الحل | 0.1 M الجليسين، درجة الحموضة 2.2. |
الجدول 2 - ما إذا كانت هناك تكوين الحلول المستخدمة في بروتوكول ISH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أظهرت الدراسات السابقة أن ISH مناسبة للكشف عن RNAs متعددة الهدف16،17،18. في هذا البروتوكول، وصفنا طريقة ISH عالية الدقة للكشف عن مرنا في السائل coelomic والتأكيد على ظروف التهجين الأمثل في سيبونكولوس nudus. أظهرت الإشارات الواضحة لـ dmrt1 التي لاحظناها التطبيق الناجح لهذا البروتوكول في الكشف عن التعبير الجيني(الشكل 2).
خلال التجربة، يجب إيلاء سلسلة من الخطوات اهتمامًا خاصًا. أولا ، يجب توليفها الريبوسوات الشعور للجينات المستهدفة باعتبارها السيطرة. بعد التوليف ، يجب فحص جودة الريبوسبر على الجل. الفقراء تخليق الحمض النووي الريبي سيؤدي إلى أي تلطيخ في الأقسام. ثانياً، يجب أن تكون عملية جمع العينة لطيفة لمنع تشوه الخلايا ويجب إجراء التجربة مباشرة بعد جمع السائل الكائي لمنع تدهور الحمض النووي الريبي. ثالثاً، يجب اتباع وقت الحضانة وأوقاتها بالضبط في جميع الخطوات دون تقصير أو إطالة. على وجه الخصوص، إيلاء الاهتمام لتوقيت علاج بروتينات K. وقت طويل جدا ً لعلاج بروتينات K سيؤدي إلى تدمير بنية الخلية للعينة ، في حين أن وقت العلاج القصير جدًا لن يسمح للريبوسبر بدخول الخلية بشكل صحيح. وأخيرا، يجب أن لا تجف الشرائح خلال التجربة. تتضمن هذه الطريقة خطوة تهجين عند درجة حرارة 60 درجة مئوية، مما سيزيد من مخاطر تبخر الكاشف. كما هو مذكور في قسم البروتوكول ، يجب وضع الشرائح في صندوق مبلل وتغطيتها بفيلم البارافين لتجنب التبخر.
أحد قيود هذا البروتوكول هو الحصول على تسلسل اتّسبالي في الكائن الحي غير النموذجي Sipunculus nudus، لأن ضعف تسلسل مرنا قد يمنح خصوصية منخفضة من الريبوبر. مع تطوير تكنولوجيا التسلسل ، سيتم إصدار المزيد والمزيد من التسلسلات عالية الجودة من Sipunculus nudus ، مما سيحسن هذا الوضع بشكل كبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل صندوق العلماء الشباب التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31801034)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة فوجيان، الصين (2016J01161)، وصناديق البحث العلمي في جامعة هواتياو (15BS306) والصندوق المبتكر للدراسات العليا في البحث العلمي بجامعة هواتشياو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A.
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
