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Imunologia e Infecção

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

Published: May 31, 2020
doi:
10.3791/61112
,
1Institute for Human Infections and Immunity,University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology,University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses,University of Texas Medical Branch

Summary

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

Abstract

제시된 절차는 감염의 비율을 결정하기 위하여 실험실 조건의 밑에 Zika 바이러스를 가진 Aedes aegypti 모기를 감염, 보급한 감염 및 문제의 모기 집단에 있는 바이러스의 잠재적인 전송을 확인하기 위하여 일반화한 방법론을 기술합니다. 이러한 절차는 전 세계적으로 벡터 역량 평가에서 다양한 수정과 함께 널리 활용됩니다. 그(것)들은 주어진모기 (즉, 종, 인구, 개별)가 주어진 에이전트의 전송에서 재생할 수 있는 잠재적인 역할을 결정하는 데 중요합니다.

Introduction

벡터 능력은 종, 인구, 심지어 개인의 수준으로 정의되며, 모기, 진드기 또는 플렙보토민 모래 와 같은 주어진 절지동물의 능력으로 정의되며, 절지동물1,2에서복제 또는 발달로 생물학적으로 에이전트를 획득 및 전송한다. 모기와 절지동물 매개 바이러스(즉, arboviruses)와 관련하여, 이 에이전트는 여성 모기에 의해 비레믹 숙주로부터 면역을 당합니다. 섭취 후, 바이러스는 중구 상피 세포3의작은 인구 중 하나를 생산적으로 감염시켜야하며, 소화 효소에 의한 프로테오분해분해, 미생물(midgut 감염 장벽 또는 MIB)의 존재, 및 분비된 수막 매트릭스와 같은 다양한 생리적 장애물을 극복해야 한다. 미드구트 상피의 감염은 바이러스의 복제와 모기의 개방 순환 시스템으로 미드구트에서 탈출, 또는 혈청 림프, 미드 구트 탈출 장벽을 극복 전파 감염의 발병을 나타냅니다 (MEB). 이 시점에서 바이러스는 이차 조직 (예를 들면, 신경, 근육 및 지방 바디)의 감염을 확립하고 복제를 계속할 수 있습니다, 비록 그 같은 이차 복제는 타액 땀샘의 아신 세포를 감염하기 위하여 바이러스를 위해 엄격하게 필요하지 않을 수 있더라도 (침샘 감염 장벽을 극복). 타액선 아시나르 세포로부터 의충구멍으로 의한 후 타액 덕트로 이동하면 바이러스를 물고 후속 호스트로 접종할 수 있게 하고, 전송 주기1,2,4,5,6,7을완료한다.

모기 벡터 내에서 확산되는 이러한 특성화되고 일반적으로 보존된 메커니즘을 감안할 때, 실험실 벡터 능력 평가는 프로토콜의 차이가1,2존재하지만종종 방법론적으로 유사합니다. 일반적으로, 경구 바이러스 노출 후, 모기는 중간구체, 다리, 난소, 또는 타액 선반과 같은 개별 조직이 바이러스 감염, 보급 감염, 보급 감염/잠재적 인 트랜스변변성 전염 및 전파 된 감염 /잠재적 인 전송 능력에 대해 분석 될 수 있도록 해부된다8. 타액선에 바이러스의 단순한 존재는, 그러나, 일부 벡터/바이러스조합1,2,4,5,7,9에서타액 선 탈출/송신 장벽(SGEB)의 증거를 감안할 때, 전송 능력의 확실한 증거가 아니다. 전송 능력을 증명하는 표준 방법은취약한동물(10,11,12)에모기 전송을 유지한다. 그러나, 많은 arboviruses에 대해 이 것들은 면역 손상된뮤린모델(13,14,15,16)의사용을 필요로 한다는 점을 감안할 때, 이 방법은 종종 비용 금지이다. 일반적으로 사용되는 대안은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 바이러스 게놈 또는 전염성 입자의 존재를 각각 입증하기 위해 전염되는 분석으로 분석될 수 있는 모기 타액의 수집이다. 이러한 체외 타액 수집 방법은 생체 내 수유 중에 증착된 바이러스의 양을12또는 과소 평가할 수 있으며, 이는 이러한 데이터를 주의해서 해석해야 한다는 것을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 체외 방법은 타액에서 바이러스의 단순한 존재의 관점에서 분석할 때 매우 유용하며, 이는 전염 가능성을 나타낸다.

arboviral 질병 발발에 있는 모기 벡터의 역할을 결정하기 위한 2개의 중요한 접근이 존재합니다. 첫 번째 방법은 모기가 활성 전송18,19,20,21,22,23,24의맥락에서 수집되는 현장감시를포함한다. 그러나, 감염률이 전형적으로 매우 낮다는 점을 감안할 때(예를 들어, 미국21에서활성 Zika 바이러스(ZIKV) 순환 영역에서 모기의 감염률 추정0.061% 추정), 잠재적 벡터 종의 유죄 는 1,600명 중 1개에서 감염된 개인을 트래핑 방법론 25,26 및 무작위 확률(예를 들어) 트래핑 방법으로 심하게 편향될 수 있다. . 이를 고려하여, 주어진 연구는 전송에 관여하는 모기를 정확하게 샘플링하기 위하여 원시 수 또는 종 다양성 둘 다에 있는 충분한 모기를 취득하지 않을 수 있습니다. 대조적으로, 벡터 능력 분석은 실험실 조정에서 착수되어 경구 복용량과 같은 매개 변수를 엄격하게 제어 할 수 있습니다. 현장 환경에서 모기 감염 및 전송 능력의 진정한 복잡성을 완전히 대표할 수는 없지만, 이러한 실험실 평가는 arbovirology 분야에서 강력한 도구로 남아 있습니다.

여러 모기 종, 인구 및방법(27,28, 29,30,31,32)에서ZIKV를 통한 다양한 벡터 역량 분석뿐만 아니라 벡터 능력 평가1의최근 검토를 기반으로, 일반적인 벡터 역량 워크플로우와 관련된 몇 가지 프로토콜을 여기에서 설명한다. 이러한 실험에서, 미주 (살바도르의 도시, 브라질; 도미니카 공화국; 그리고 낮은 리오 그란데 밸리, TX, 미국)에서 세 Ae. aegypti 인구는 ZIKV의 단일 변형에 노출되었다 (멕스 1-7, GenBank 가입: KX247632.1) 4, 5, 또는 6 로그10 초점 단위에 의해 인공 요법 이어서, 해부 및 세포 배양 기반 전염 분석등을 통해 다양한 시간 동안 외래 배양(2, 4, 7, 10 및 14일)을 거쳐 감염, 보급감염 및 전송 능력의 증거를 분석하였다. 현재 워크플로/프로토콜은 ZIKV에 최적화되어 있지만, 많은 원소는 절지동물 봉쇄 및 생물 안전 수준 2 및 3(ACL/BSL2 또는 ACL/BSL3)에서 다른 모기 매개 아르보바이러스와 직접 변형될 수 있습니다.

Protocol

이러한 프로토콜에서 수행된 모든 절차는 기관 생물 안전 위원회와 갤버스턴에 있는 텍사스 대학 의료 지점의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜을 완전히 준수하여 수행되었습니다. 1. 베로 셀에서 ZIKV 증폭 베로 세포(CCL-81 또는 VeroE6)는 덜벡코의 이글의 최소한의 필수 매체(DMEM)를 10% v/v 열불성 태아소 혈청(FBS)으로 보충하고, 1% (v/v) 페니실린-스?…

Representative Results

Ae의 세 인구. 미주(살바도르, 브라질, 도미니카 공화국; 리오 그란데 밸리, TX, 미국)의 아이집트는 미주(ZIKV Mex 1-7, 치아파스 주, 멕시코, 2015)에서 혈액밀 티터(4, 5, 6 log10 FFU/mL)에서 인공 혈액 세척을 통해 ZIKV의 발병 균주에 노출되었다. 일 2, 4, 7, 10 및 14 소독에서, 모기의 하위 세트는 감염, 보급 및 잠재적 인 전송 속도를 결정하기 위해 처리되었다. 4로그10</s…

Discussion

여기에 설명된 메서드는 벡터 역량 분석을 수행하기 위한 일반화된 워크플로우를 제공합니다. 일반적인 틀로서, 이러한 방법론의 대부분은 문학 전체에 걸쳐 보존된다. 그러나 수정할 여지가 있습니다(아자르와 위버1에서검토됨). 바이러스(예를 들어, 바이러스 계보, 도전 바이러스의 저장, 바이러스 통로 역사), 곤충학(예를 들어, 모기 집단의 실험실 식민지화, 타고난 면역, 모?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 신흥 바이러스 및 Arboviruses (WRCEVA)에 대한 세계 참조 센터의 직원을 인정 : 박사 로버트 테시, 힐다 구즈만, 박사 케네스 플랜테, 박사 제시카 플랜트, 디오나 샤튼, 그리고 디비야 미르 찬다니, 큐레이팅및 우리와 다른 그룹의 능력 실험에 사용되는 바이러스 균주의 많은 을 제공하는 그들의 지칠 줄 모르는 작업에 대한. 제시된 작품은 맥러플린 펠로우십 펀드(SRA)와 NIH 보조금 AI120942 및 AI121452에 의해 지원되었다.

Materials

3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
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Referências

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Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).
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