O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.
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Artigo de método
Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os procedimentos apresentados descrevem uma metodologia generalizada para infectar mosquitos Aedes aegypti com zika vírus em condições laboratoriais para determinar a taxa de infecção, infecção disseminada e potencial transmissão do vírus na população do mosquito em questão. Esses procedimentos são amplamente utilizados com várias modificações nas avaliações de competência vetorial globalmente. São importantes na determinação do papel potencial que um determinado mosquito (ou seja, espécie, população, indivíduo) pode desempenhar na transmissão de um determinado agente.
Introdução
A competência vetorial é definida como a capacidade no nível de espécies, população e até mesmo um indivíduo, de um determinado artrópode, como um mosquito, carrapato ou mosca de areia de flebotomina, para adquirir e transmitir um agente biologicamente com replicação ou desenvolvimento no artrópode1,2. Com relação a mosquitos e vírus transmitidos por artrópodes (ou seja, arboviroses), o agente é absorvido de um hospedeiro virêmico por uma fêmea de mosquito. Após a ingestão, o vírus deve infectar produtivamente uma pequena população de células epiteliais midgut3, superando vários obstácu....
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Protocolo
Todos os procedimentos realizados nesses protocolos foram realizados em pleno cumprimento dos protocolos aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Filial Médica da Universidade do Texas em Galveston.
1. Amplie o ZIKV em células Vero
- Cultivar células Vero (CCL-81 ou VeroE6) na modificação de Dulbecco do meio essencial mínimo (DMEM) da Eagle suplementado com 10% v/v de soro bovino fetal inativado (FBS) e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (100 U/mL e 100 μg/mL, respectivamente) em uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2 a entre 80-90% de conf....
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Resultados
Três populações de Ae. aegypti das Américas (Salvador, Brasil; República Dominicana; e o Vale do Rio Grande, TX, EUA) foram expostos a um surto de ZIKV das Américas (ZIKV Mex 1-7, Estado de Chiapas, México, 2015) sobre uma gama de de farinha de sangue (4, 5 e 6 log10 FFU/mL) apresentados em um eritrócito humano lavado. Nos dias 2, 4, 7, 10 e 14 pós-infecção, subconjuntos de mosquitos foram processados para determinar as taxas de infecção, disseminação e potencial de transmissão.
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Discussão
Os métodos aqui descritos fornecem um fluxo de trabalho generalizado para a realização de análises de competência vetorial. Como estrutura geral, muitas dessas metodologias são conservadas ao longo da literatura. No entanto, há espaço substancial para modificações (revisadas em Azar e Weaver1). Vírus (por exemplo, linhagem viral, armazenamento de vírus de desafio, histórico de passagem viral), entomologia (por exemplo, colonização laboratorial de populações de mosquitos, imunidade inata, microbiom.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Reconhecemos a equipe do Centro Mundial de Referência para Vírus Emergentes e Arboviroses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, por seu trabalho incansável na curadoria e fornecimento de muitas das cepas virais usadas para nossos e outros grupos experimentos de competência vetorial. O trabalho apresentado foi financiado pelas bolsas McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e nih grants AI120942 e AI121452.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reservatório Padrão 3mL | R37P30 | Hemotek Ltd | Equipamento Insetário |
| 7/32" Aço Inoxidável 440 Grau C Bolas | 4RJH9 | Grainger | Meio de Moagem |
| Acetona, Grau Histológico, Fisher Chemicals, Garrafa Poli, 4L, 4/Caixa | A16-P4 | FisherScientific | Fixador |
| Adenosina 5'-trifospato sal dissódico hydrat, microbiano, BioReagente, adequado para célula cultura | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagente |
| Anti-Flavivírus Anticorpo de antígeno de grupo, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Anticorpo primário para ensaio de formação de foco |
| Anti-IgG de camundongo (H + L) Anticorpo, soro humano adsorvido e marcado com peroxidase, 1,0 mL / garrafa | 5450-0011 | KPL / Seracare | Anticorpo secundário para ensaio de formação de foco |
| Alvejante | NC0427256 | Descontaminação FisherScientific | |
| Corning, Frascos Tratados para Cultura de Células, 150cm2, Tampa Ventilada, Caixa de 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Placas |
| , 24 poços, 5/saco, 100/caixa, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | |
| Placas de Cultura de Células Costar consumíveis para cultura de células, 96 poços, 5/saco, 100/caixa, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Consumível de cultura de células |
| Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
| Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubos, 500/Caixa | 05-402-7 | FisherScientific | Plástico consumível |
| Falcon 15mL Tubos Cônicos Centrigue | 14-959-70C | FisherScientific | Plástico consumível |
| Falcon 50mL Tubos Cônicos Centrigue | 14-959-49A | Pipetas | |
| sorológicas de poliestireno descartáveis FisherScientific Scientific consumíveis de plástico Falcon 10mL, 200/Case | 13-675-20 | Pipetas | |
| sorológicas de poliestireno descartáveis FisherScientific Scientific consumíveis de plástico Falcon 1mL, 1000/Case | 13-675-15B | Pipetas | |
| sorológicas de poliestireno descartáveis Falcon consumíveis de plástico FisherScientific 25mL, 200/Case | 13-675-30 | Pipetas | |
| sorológicas de poliestireno descartáveis FisherScientific Plastic consumíveis Falcon 5mL, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumível |
| Falcon Standard Tissue Culture Plates | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumível |
| Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Reagente |
| de cultura de célulasLâminas de Microscópio de Vidro Simples Econômico Fisherbrand | 12-550-A3 | FisherScientific | Imobilização de Mosquitos |
| FU1 Alimentador | FU1-0 | Hemotek Ltd | Equipamento Insetário; unidades de alimentação |
| Gibco DPBS com Cálcio e Magnésio, 10 x Garrafas de 500mL | 140-040-182 | Reagente de cultura de células | FisherScientific |
| Gibco Fungizone, Anfotericina B, 250μ g/mL, 50mL/Frasco | 15-290-026 | Reagente de cultura de células | Fisher Scientific |
| Gibco Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL), 100mL/Frasco, 20 Frascos/Caixa | 15-140-163 | Reagente de cultura de células | FisherScientific |
| Gibco, Tripsina-EDTA (25%), vermelho de fenol, 20 frascos de 100mL | 25-200-114 | Reagente de cultura de células | FisherScientific |
| Gibcom DMEM, alto teor de glicose, 10 frascos | de 500mL11-965-118 | Reagente de cultura de células | FisherScientific |
| Sangue humano, gênero não especificado, Na-Citrate, 1 Unidade | 7203706 | Lampire | Preparação de farinha de sangue |
| Aspirador InsectaVac | 2809B | Bioquip | Equipamento Insetário |
| Metanol, Certificado ACS, Fisher Chemicals, Frasco de Vidro Âmbar, 4L, 4/Caixa | A412-4 | Fixador | |
| FisherScientificMetilcelulose, viscosidade: 3.500-5.600 cP, 2% em água (20 ° C), 250g / Garrafa | M0512-250G | MilliporeSigma | Reagente de cultura de células |
| Micro-chem Plus Detergente Desinfetante | C849T34 | Thomas Descontaminação Científica | ; diluição de trabalho de óleo mineral de amônio quaternário duplo |
| , BioReagente, para biologia molecular | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Imobilização de mosquitos |
| O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Equipamento de Insetário |
| Plugues de Plástico | PP5-250 | Hemotek Ltd | Equipamento de Insetário |
| PS6 Unidade de Energia (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Equipamento de Inseto; fonte de energia |
| Pinça Rubis, lâminas deslocadas, pontas superfinas | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
| Sarstedt Inc, Microtubo de Tampa de Rosca de 2mL, Fundo Cônico, Tampa de O-ring, Estéril, 1000/Caixa | 50-809-242 | FisherScientific | Plástico consumível |
| Sacarose, BioUltra, para biologia molecular | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μ L Ponteiras de Pipeta, 100 pontas/Rack, 8 Racks/Pacote, 4 Pacotes/Caixa | 21-402-487 | Consumível de plástico | FisherScientific |
| ThermoScientific, Barreira ART Baixa Retenção 200μ L Ponteiras de Pipeta, 96 pontas/Rack, 10 Racks/Pacote, 5 Pacotes/Caixa | 21-402-486 | FisherScientific | Consumível de plástico |
| ThermoScientific, Barreira ART de Baixa Retenção 20μ L Ponteiras de Pipeta, 96 pontas/Rack, 10 Racks/Pacote, 5 Pacotes/Caixa | 21-402-484 | Consumível de plástico | FisherScientific |
| ThermoScientific, Barreira ART de Baixa Retenção, Alcance Estendido 10μ L Ponteiras de pipeta, 96 ponteiras/rack, 10 racks/pacote, 5 pacotes/caixa | 21-402-482 | FisherScientific | PlasticLyser |
| II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
| TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Solução de desenvolvimento para ensaio de formação de foco |
| Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Linhagem celular de mamíferos para amplificar vírus e realizar ensaio infeccioso |
| Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | Coleção de Cultura de Tipo Americano | Linha celular de mamíferos para amplificar vírus e realizar ensaio infeccioso |
Referências
- Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867(2019).
- Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
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Reimpressões e permissões
