Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus
Summary
O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.
Abstract
Os procedimentos apresentados descrevem uma metodologia generalizada para infectar mosquitos Aedes aegypti com zika vírus em condições laboratoriais para determinar a taxa de infecção, infecção disseminada e potencial transmissão do vírus na população do mosquito em questão. Esses procedimentos são amplamente utilizados com várias modificações nas avaliações de competência vetorial globalmente. São importantes na determinação do papel potencial que um determinado mosquito (ou seja, espécie, população, indivíduo) pode desempenhar na transmissão de um determinado agente.
Introduction
A competência vetorial é definida como a capacidade no nível de espécies, população e até mesmo um indivíduo, de um determinado artrópode, como um mosquito, carrapato ou mosca de areia de flebotomina, para adquirir e transmitir um agente biologicamente com replicação ou desenvolvimento no artrópode1,2. Com relação a mosquitos e vírus transmitidos por artrópodes (ou seja, arboviroses), o agente é absorvido de um hospedeiro virêmico por uma fêmea de mosquito. Após a ingestão, o vírus deve infectar produtivamente uma pequena população de células epiteliais midgut3, superando vários obstáculos fisiológicos, como a degradação proteolítica por enzimas digestivas, a presença da microbiota (barreira de infecção midgut, ou MIB), e a matriz peritrofídica secretada. A infecção do epitélio midgut deve ser seguida pela replicação do vírus e eventual fuga do midgut para o sistema circulatório aberto do mosquito, ou hemoglifo, o que representa o aparecimento de uma infecção disseminada superando a barreira de escape midgut (MEB). Neste ponto, o vírus pode estabelecer infecções de tecidos secundários (por exemplo, nervos, músculos e corpos de gordura) e continuar a se replicar, embora essa replicação secundária possa não ser estritamente necessária para que o vírus infecte as células acinares das glândulas salivares (superando a barreira da infecção da glândula salivar). O lagross das células acinares da glândula salivar em suas cavidades apical e, em seguida, o movimento no ducto salivar permite a inoculação do vírus em hospedeiros subsequentes na mordida, e completa o ciclo de transmissão1,2,4,5,6,7.
Dado esse mecanismo bem caracterizado e geralmente conservado de disseminação dentro de um vetor de mosquitos, as avaliações de competência vetorial laboratorial são muitas vezes metodologicamente semelhantes, embora existam diferenças nos protocolos1,2. Geralmente, após a exposição ao vírus oral, os mosquitos são dissecados para que tecidos individuais como o midgut, pernas, ovários ou glândulas salivares possam ser testados para infecção viral, infecção disseminada, infecção disseminada/transmissão transovarial potencial e competência de transmissão disseminada/potencial,respectivamente 8. A mera presença de um vírus nas glândulas salivares, no entanto, não é evidência definitiva da capacidade de transmissão, dada a evidência de uma barreira de fuga/saída da glândula salivar (SGEB) em algumas combinações vetoriais/vírus1,2,4,5,7,9. O método padrão para comprovar a competência de transmissão continua sendo a transmissão do mosquito para um animal suscetível10,11,12. No entanto, dado que para muitas arboviroses isso requer o uso de modelos murinas imunocomprometidos13,14,15,16, este método muitas vezes é proibitivo. Uma alternativa comumente utilizada é a coleta da saliva do mosquito, que pode ser analisada por reação de cadeia transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) ou um ensaio infeccioso para demonstrar a presença do genoma viral ou partículas infecciosas, respectivamente. Vale ressaltar que tais métodos de coleta de saliva in vitro podem superestimar12 ou subestimar17 a quantidade de vírus depositado durante a alimentação in vivo, indicando que tais dados devem ser interpretados com cautela. No entanto, o método in vitro é altamente valioso quando analisado na perspectiva da mera presença de vírus na saliva, indicando potencial de transmissão.
Existem duas abordagens importantes para determinar o papel dos vetores de mosquitos em surtos de doenças arbovirais. O primeiro método envolve a vigilância em campo, na qual os mosquitos são coletados no contexto de transmissão ativa18,19,20,21,22,23,24. No entanto, dado que as taxas de infecção são tipicamente bastante baixas (por exemplo, a taxa estimada de infecção de 0,061% de mosquitos em áreas de circulação ativa do vírus Zika (ZIKV) nos Estados Unidos21), a incriminação de espécies vetoriais potenciais pode ser fortemente tendenciosa pela metodologia de captura25,26 e chance aleatória (por exemplo, amostragem de um indivíduo infectado de 1.600 não infectados)2 . Levando isso em conta, um determinado estudo pode não adquirir mosquitos suficientes tanto em números brutos quanto na diversidade de espécies para amostrar com precisão os mosquitos envolvidos na transmissão. Em contrapartida, as análises de competência vetorial são realizadas em ambiente laboratorial, permitindo um controle rigoroso de parâmetros como a dose oral. Embora não sejam totalmente capazes de representar a verdadeira complexidade da infecção por mosquitos e da capacidade de transmissão em um ambiente de campo, essas avaliações laboratoriais permanecem ferramentas poderosas no campo da arbovirologia.
Com base em diversas análises de competência vetorial com ZIKV em diversas espécies de mosquitos, populações e métodos27,28,29,30,31,32, bem como uma revisão recente das avaliações de competência vetorial1,descrevemos aqui vários dos protocolos associados a um típico fluxo de trabalho de competência vetorial. Nestes experimentos, três Ae. populações de aegypti das Américas (cidade de Salvador, Brasil; República Dominicana; e do baixo Vale do Rio Grande, TX, EUA) foram expostas a uma única cepa de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 ou 6 log10 unidades de formação focal (FFU)/mL por meio de doses de sangue artificial. Posteriormente, foram analisadas evidências de infecção, infecção disseminada e competência de transmissão após vários momentos de incubação extrínseca (2, 4, 7, 10 e 14 dias) por meio de dissecção e ensaio infeccioso baseado em cultura celular. Embora o fluxo de trabalho/protocolos atual seja otimizado para ZIKV, muitos elementos são diretamente traduzíveis para outras arboviroses transmitidas por mosquitos nos níveis de contenção de artrópodes e biossegurança 2 e 3 (ACL/BSL2 ou ACL/BSL3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos aqui descritos fornecem um fluxo de trabalho generalizado para a realização de análises de competência vetorial. Como estrutura geral, muitas dessas metodologias são conservadas ao longo da literatura. No entanto, há espaço substancial para modificações (revisadas em Azar e Weaver1). Vírus (por exemplo, linhagem viral, armazenamento de vírus de desafio, histórico de passagem viral), entomologia (por exemplo, colonização laboratorial de populações de mosquitos, imunidade…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos a equipe do Centro Mundial de Referência para Vírus Emergentes e Arboviroses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, por seu trabalho incansável na curadoria e fornecimento de muitas das cepas virais usadas para nossos e outros grupos experimentos de competência vetorial. O trabalho apresentado foi financiado pelas bolsas McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e nih grants AI120942 e AI121452.
Materials
| 3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| 7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
| Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
| Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
| Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
| Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
| Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
| Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
| Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
| FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
| Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
| InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
| Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
| Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
| Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
| Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
| O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
| Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
| Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
| TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
| TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
| Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
| Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
Referências
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