Modellering van leeftijdsgegende neurodegeneratieve ziekten bij Caenorhabditis elegans
Summary
Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten te monitoren en te ontleden.
Abstract
Het bestrijden van menselijke neurodegeneratieve pathologieën en het beheren van hun alomtegenwoordige sociaal-economische impact wordt een wereldwijde prioriteit. Ondanks hun schadelijke effecten op de kwaliteit van het menselijk leven en de gezondheidszorg, de meerderheid van de menselijke neurodegeneratieve aandoeningen nog steeds ongeneeslijk en niet te voorkomen. Daarom wordt de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies tegen dergelijke kwalen een dringende urgentie. Leeftijd-geassocieerde verslechtering van neuronale circuits en functie is evolutionair bewaard in organismen zo divers als de nederige worm Caenorhabditis elegans en mensen, wat gelijkenissen in de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen. C. elegans is een zeer kneedbaar genetisch model, dat een goed gekarakteriseerd zenuwstelsel, lichaamstransparantie en een divers repertoire van genetische en beeldvormingstechnieken biedt om neuronale activiteit en kwaliteitscontrole tijdens veroudering te beoordelen. Hier introduceren en beschrijven we methodologieën met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose (bijvoorbeeld deg-3(d) pt mec-4(d)) en eiwitaggregaat (bijvoorbeeld α-syuncleine en poly-glutamaat)-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neuronale afbraak te monitoren en te ontleden. Een combinatie van deze dierlijke neurodegeneratiemodellen, samen met genetische en farmacologische schermen voor celdoodmodulators zal leiden tot een ongekend begrip van leeftijdsgebonden afbraak van neuronale functie en zal kritische inzichten opleveren die een brede relevantie hebben voor de menselijke gezondheid en kwaliteit van leven.
Introduction
In de afgelopen twee decennia is C. elegans op grote schaal gebruikt als een modelorganisme om de moleculaire mechanismen van necrotische celdood te onderzoeken. C. elegans biedt een uitzonderlijk goed gekarakteriseerd en in kaart gebracht zenuwstelsel, transparante lichaamsstructuur en een divers repertoire van genetische en beeldvormingsmethoden om in vivo cellulaire functie en overleving tijdens veroudering te monitoren. Zo zijn verschillende C. elegans genetische modellen van neurodegeneratie al ontwikkeld om de levensvatbaarheid van neuronalen te beoordelen. In het bijzonder omvatten goed beschreven en gebruikte nematodemodellen de hyperactieve ionenkanaalgeïnduceerde necrose1,,2,3 en celdood veroorzaakt door verhoogde eiwitaggregatatie4,,5,,6,7,,8,,9,10 en hitteberoerte11,12,onder anderen.
Blootstelling op korte termijn aan onder dodelijke temperaturen verleende weerstand tegen necrotische celdood, veroorzaakt door een daaropvolgende hittestress, zowel bij aaltjes als zoogdierneuronen11. Interessant is dat de dagelijkse conditionering van aaltjes bij een milde verhoogde temperatuur beschermt tegen neurodegeneratie, die wordt toegebracht door diverse stimuli, zoals ionische onbalans (bijvoorbeeld mec-4(u231) en/of deg-3(u662)) en eiwitaggregatie (bijvoorbeeld α-synuclein en polyQ40)11,13.
Hier beschrijven we veelzijdige methodologieën met behulp van C. elegans om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie te monitoren en te evalueren in gevestigde modellen van menselijke ziekten, zoals excitotoxiciteit-geactiveerde celdood, Parkinson en de ZvH. Bovendien onderstrepen we de neuroprotectieve rol van warmteconditionering in verschillende modellen van neurodegeneratie. Een combinatie van deze technieken in combinatie met genetische en/of farmacologische schermen zal resulteren in de identificatie en karakterisering van nieuwe celdoodmodulatoren, met potentieel therapeutisch belang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden voor groei, synchronisatie en microscopisch onderzoek van enkele veelzijdige C. elegans-modellen die leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie onderzoeken. In het bijzonder beoordelen en ontleden we de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgebonden neuronale afbraak met behulp van hypergeactiveerde ionenkanaal-geïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit1,<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Chaniotakis M. en Kounakis K. voor het opnemen en bewerken van video’s. K.P. wordt gefinancierd met een subsidie van de Helleense Stichting voor Onderzoek en Innovatie (HFRI) en het Secretariaat-generaal voor Onderzoek en Technologie (GSRT). N.T. wordt gefinancierd door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC – GA695190 – MANNA), de kaderprogramma’s van de Europese Commissie en het Griekse ministerie van Onderwijs.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
Referências
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson’s disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
