Modelar enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad en Caenorhabditis elegans

Summary

Aquí, introducimos y describimos metodologías ampliamente accesibles que utilizan algunos modelos versátiles de nematodos, incluyendo necrosis inducida por canales de iones hiperactivados y neurotoxicidad inducida por agregados de proteínas, para monitorear y diseccionar los fundamentos celulares y moleculares de las enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad.

Abstract

La lucha contra las patologías neurodegenerativas humanas y la gestión de su impacto socioeconómico generalizado se está convirtiendo en una prioridad mundial. A pesar de sus efectos perjudiciales sobre la calidad de vida humana y el sistema sanitario, la mayoría de los trastornos neurodegenerativos humanos siguen siendo incurables y no prevenibles. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas contra tales enfermedades se está convirtiendo en una urgencia apremiante. El deterioro y la función neuronales asociados a la edad se conserva evolutivamente en organismos tan diversos como el humilde gusano Caenorhabditis elegans y los seres humanos, lo que significa similitudes en los mecanismos celulares y moleculares subyacentes. C. elegans es un modelo genético altamente maleable, que ofrece un sistema nervioso bien caracterizado, transparencia corporal y un diverso repertorio de técnicas genéticas y de imagen para evaluar la actividad neuronal y el control de calidad durante el envejecimiento. Aquí, introducimos y describimos metodologías que utilizan algunos modelos versátiles de nematodos, incluyendo necrosis inducida por canal de iones hiperactivado (por ejemplo, deg-3(d) y mec-4(d)) y agregado de proteínas (por ejemplo, neurotoxicidad inducida por é-syunclein y poli-glutamato), para monitorear y diseccionar los elementos celulares moleculares y discretos de la descomposición celular y relacionada con la edad. Una combinación de estos modelos de neurodegeneración animal, junto con las pantallas genéticas y farmacológicas para los moduladores de muerte celular conducirá a una comprensión sin precedentes de la descomposición de la función neuronal relacionada con la edad y proporcionará conocimientos críticos con amplia relevancia para la salud humana y la calidad de vida.

Introduction

Durante las últimas dos décadas, C. elegans ha sido ampliamente utilizado como un organismo modelo para investigar los mecanismos moleculares de la muerte celular necrótica. C. elegans ofrece un sistema nervioso excepcionalmente bien caracterizado y mapeado, una estructura corporal transparente y un diverso repertorio de métodos genéticos y de imagen para monitorear la función celular in vivo y la supervivencia durante todo el envejecimiento. Por lo tanto, varios modelos genéticos de C. elegans de neurodegeneración ya han sido desarrollados para evaluar la viabilidad neuronal. En particular, los modelos de nematodos bien descritos y usados incluyen la necrosis inducida por el canal de^ioneshiperactivos 1 ,^2,3 y la muerte celular desencadenada por el aumento de la agregación de proteínas^{4,5,6,7,8,9,10} y la carrera de calor^11,12, entre otros.^,

La exposición a corto plazo a temperaturas sub letales confirió resistencia a la muerte de células necróticas, provocada por una posterior tensión térmica tanto en nematodos como en neuronas de mamíferos¹¹. Curiosamente, el preacondicionamiento diario de nematodos a una temperatura elevada suave protege contra la neurodegeneración, que es infligida por diversos estímulos, tales como desequilibrio iónico (por ejemplo, mec-4(u231) y/o deg-3(u662)) y la agregación de proteínas (por ejemplo, sinucleína y poliQ40)^11,13.

Aquí, describimos metodologías versátiles utilizando C. elegans para monitorear y evaluar la neurodegeneración dependiente de la edad en modelos bien establecidos de enfermedades humanas, como la muerte celular desencadenada por excitotoxicidad, el Parkinson y la enfermedad de Huntington. Además, subrayamos el papel neuroprotector del preacondicionamiento térmico en varios modelos de neurodegeneración. Una combinación de estas técnicas junto con pantallas genéticas y/o farmacológicas dará lugar a la identificación y caracterización de nuevos moduladores de muerte celular, con potencial interés terapéutico.

Protocol

1. Células necróticas inducidas por canales iónicos hiperactivos NOTA: Las mutaciones de ganancia de función en la familia genética de degenerinas, incluyendo mec-4 y deg-3 entre otros, dan como resultado la generación de canales de iones hiperactivos que desencadenan la muerte de células necróticas de seis neuronas receptoras táctiles necesarias para la mecanosensación en gusanos3. La necrosis inducida por la estimulación aberrante de degener…

Representative Results

Muerte celular necrótica inducida por canales iónicos hiperactivosUtilizando los procedimientos presentados aquí, los embriones mutantes mec-4(u231) y deg-3u662) fueron incubados durante 25 min a 34 oC o mantenidos a una temperatura estándar de 20 oC. Tras la eclosión, el número de cadáveres celulares neuronales se determinó en la etapa larval L1 de ambos grupos. La muerte celular necrótica disminuye en los nematodos que eclosionaron a causa de los huevos preacobidos por ch…

Discussion

Aquí, introducimos y describimos metodologías ampliamente accesibles para el crecimiento, sincronización y examen microscópico de algunos modelos versátiles de C. elegans que investigan la neurodegeneración dependiente de la edad. En particular, evaluamos y diseccionamos los fundamentos celulares y moleculares de la descomposición neuronal relacionada con la edad mediante el uso de necrosis inducida por canales iónicos hiperactivados y neurotoxicidad inducida por agregados de^{proteínas …}

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)	Zeiss		Axio Vert A1
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
Epifluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific		EVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Tetramisole hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]			Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)