Summary
该方案的目标是比较不同的细胞外基质（ECM）包被条件，以评估差异涂层如何影响诱导多能干细胞（iPSC）的生长速率。特别是，我们的目标是创造条件以获得iPSC培养物的最佳生长。
Abstract
本研究的重点是了解在不同ECM包衣底物上生长iPSC如何影响细胞汇合。已经建立了实时评估iPSC汇合的协议，而无需对单细胞悬液中的细胞进行计数，以避免任何生长扰动。使用高内涵图像分析系统以自动方式评估 4 种不同 ECM 上的 iPCS 汇合度。使用不同的分析设置来评估贴壁iPSC的细胞汇合度，并且仅观察到使用60%、80%或100%面膜的微小差异（在层粘连蛋白24和48小时）。我们还表明，与基质胶，玻连蛋白和纤连蛋白相比，层粘连蛋白导致最佳汇合。
Introduction
诱导多能干细胞（iPSC）是从体细胞中获得的，可以分化成不同的细胞类型。它们通常被用作模拟疾病发病机制或进行药物筛选的系统，并且还提供了用于个性化医疗的潜力。由于iPSCs具有巨大的潜力，因此充分表征它们以用作可靠的模型系统非常重要。我们之前展示了在缺氧环境中生长iPSCs的重要性，因为这些细胞依赖于糖酵解，而有氧环境会导致氧化还原失衡1。iPSCs也容易受到其他培养条件的影响，特别是细胞外环境。优化培养条件是保持其健康和增殖的关键问题。健康的iPSC培养将产生健康的分化细胞，这些分化细胞通常是用于了解特定人类疾病或细胞过程的分子，细胞和功能特征的模型的终点。
在这项研究中，已经使用一个简单的方案来测试在不同孔中使用不同包衣条件的iPSCs的汇合度。iPSCs需要鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的饲养层才能正确附着，但是iPSCs和MEF的共存使得难以进行RNA或蛋白质提取等分析，因为存在两个细胞群。为了避免饲养层，属于细胞外基质（ECM）的不同蛋白质已被用于重建天然细胞生态位并具有无饲养层iPSC培养物。特别是，Matrigel是从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的可溶基底膜制剂，其富含细胞外基质蛋白（即层粘连蛋白，胶原蛋白IV，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，entactin/nidogen和生长因子）2，3。其他使用的包被条件是纯化的蛋白质，这些蛋白质在构建ECM中具有已知的相关性：已知层粘连蛋白-521由胚胎内部细胞团中的人多能干细胞（hPSCs）分泌，它是出生后体内最常见的层粘连蛋白之一4，5，6，7，8，9， 10，11;玻连蛋白是一种无异种细胞培养基质，已知可支持hPSC12，13，14，15，16的生长和分化;纤连蛋白是一种ECM蛋白，对脊椎动物发育以及胚胎干细胞在多能状态下的附着和维持很重要17，18，19，20，21，22，23，24，25。由于存在不同的包被条件，我们根据它们对iPSC汇合的影响来比较它们。
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Protocol
1. 涂覆 96 孔板
注意：在同一板中测试不同的涂层，但不同的孔（见 补充文件）。
- 在DMEM中以1：100稀释基质胶。向96孔板中每孔加入100μL，并在室温下孵育1小时。之后，除去溶液并用 100 μL DMEM 洗涤孔两次。
- 在PBS（含钙和镁）中稀释层粘连蛋白（20μg/ mL，LN-521）。向孔中加入100μL并在4°C下孵育过夜。第二天在接种细胞之前用DMEM进行两次洗涤。
- 在稀释缓冲液中稀释玻连蛋白（10μg/mL）。向 96 孔板中每孔加入 100 μL，并在室温下孵育 1 小时。在电镀细胞之前，用PBS（不含钙和镁）清洗孔。
- 在ddH2O中稀释HU-纤连蛋白（30μg/ mL），向孔中加入100μL并在室温下孵育45分钟。之后，在接种细胞之前用培养基清洗孔。
2. 培养中iPSCs的维持
注意：iPSC 是商业购买的。iPSCs来源于健康的人成纤维细胞，并使用游离体技术重新编程。
- 从-80°C冰箱或液氮中，在37°C水浴中解冻冷冻保存的iPSC。在将其移入生物安全柜之前，用70%乙醇清洁装有细胞的小瓶。
- 用 1000 μL 移液器在 15 mL 无菌锥形管中逐滴将细胞悬液加入 5 mL 预热的细胞培养基（例如 mTeSR1）中。
- 在室温（RT）下以304× g 离心细胞5分钟。
- 取出培养基并将细胞沉淀重悬于 4 mL 细胞培养基中。
- 将细胞悬液接种到 6 孔板的两个孔中（每个 6 孔细胞培养皿 105 个 iPSC），其中小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 先前已接种。在DMEM中以2.4 x 104 / cm2 的密度接种iPSCs前两天播种MEF（含有10%胎牛血清，1%L-谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素）。
- 接种后，用10μM的ROCK抑制剂Y-27632补充细胞培养基。
- 在 MEF 上培养 iPSC 前 4-5 周，然后在无饲养层条件下（无 MEF 条件），使用 mTeSR1 中感兴趣的包衣之一（参见步骤 1 和 表 1）。
- 当 iPSC 汇合 70-80% 时，使用 0.5 mM EDTA 处理在室温下 1：4 传代 3-5 分钟。 为 6 孔板添加 1 mL 的 0.5 mM EDTA（或其他类型的板按比例）。在无饲养器条件下转移到新孔中，并在37°C，5%CO 2，20%O2下孵育。
- 每天用新鲜的mTeSR1更换培养基，每2天分裂一次细胞。
3. 细胞汇合的表征
- 使用96孔板进行实验。
- 在无饲养层条件下培养至少 1 个月后，每孔接种 10，000 个细胞，以确保 MEF 未传代。使用一次性计数玻片用光学显微镜对细胞进行计数。
- 一式三份进行实验。因此，在三个孔中测试每个播种条件。
- 从接种后的第1天开始，在明场模式下使用细胞仪进行自动图像采集。每24小时进行一次自动图像采集，持续5天。有关实验参数的详细信息，请参阅 补充文件。
- 使用自动对比和自动曝光来更好地可视化细胞。
- 设置汇合分析的分析设置（参见 补充文件），以应用每孔60%、80%和100%的掩模，以评估由于孔边界的光折射引起的焦点变化。使用上面提到的不同掩模分析设置来分析每个时间点的细胞汇合度。
4. 统计分析
- 将定量结果报告为平均值的标准误差 （SEM） ±平均值。
- 为了比较不同涂层条件的总体差异，使用相同的样本获取数据并执行学生配对样本t检验。小于 0.05 的 P 值被认为具有统计显著性，并且所有报告的 p 值都是双侧的。
5. 细胞骨架微丝的表征
- 用4%多聚甲醛（4%PFA）在PBS中固定细胞在室温下10分钟，然后在PBS中洗涤两次（总共10分钟）。
- 在室温下向每个孔中加入 100 μL 封闭溶液（由 5% BSA、0.1% Triton 在 PBS 中组成）1 小时。
- 除去封闭溶液并用PBS洗涤样品两次10分钟。
- 每个样品加入 100 μL 鬼笔环肽偶联工作溶液，并在室温下孵育 1 小时。
- 用PBS洗涤细胞两次（室温下10分钟）。
- 用Hoechst 33342染色细胞核，在PBS中稀释1：10000，在室温下10分钟。
- 取出Hoechst溶液，用PBS洗涤细胞两次，每次10分钟。
- 用H2O洗涤样品，并在化学罩下干燥。
- 加入 100 μL 封片剂（即 PBS：甘油，1：1）以覆盖细胞并保留样品荧光。
- 在配备白光激光 （WLL） 源和 405 nm 二极管激光器的激光扫描共聚焦显微镜上观察 Ex/Em 493/517 nm 处的细胞。使用HC PLAPO 40x油浸物镜采集连续共聚焦图像。对所有检查样品使用相同的激光功率、分束器、滤光片设置、针孔直径和扫描模式。
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Representative Results
在这项研究中，我们研究了在不同包衣条件下生长时的iPSCs汇合。使用细胞仪，我们能够在5天内获得一式三份的简单信息结果。由于iPSCs几乎不附着在塑料容器上，并且需要涂层来支持其增殖，因此我们决定监测人iPSC的汇合，因为它表明细胞培养物的健康状况，并可能反映其分化潜力。体外扩增后，我们将iPSCs接种在不同的ECM底物上，并通过观察在明场中获得的样品图像并使用鬼笔环肽染色（用于染色肌动蛋白丝，也称为F-肌动蛋白）来分析细胞，以了解它们对血管的粘附（图1）。事实上，鬼笔环肽染色可以可视化细胞对容器表面的粘附程度，从而可视化到用于容器的特定涂层。粘附在涂层上的细胞显示出清晰可见的细胞骨架微丝，而不是塌陷的微丝。明场与鬼笔环肽染色相结合的观察表明，iPSCs对包被表面的粘附水平良好。
为了研究汇合，我们将iPSCs与基质胶，LN-521，玻连蛋白和Hu-纤连蛋白一式三份接种，并进行了三次实验。为了避免由于孔边缘引起的光折射，我们应用了三种类型的分析设置，掩模为60%，80%和100%，并观察到它们在拾取细胞和避免背景方面相似（图2）。获得的结果表明，接种在LN-521上的iPSCs随着时间的推移显示出线性方式的高细胞增殖速率，与其他包衣相比，这些差异具有统计学意义（ 图3A-C中的星号）。接种在基质胶，玻连蛋白或Hu-纤连蛋白上的细胞在前96小时内显示出线性增殖速率，但它们在过去24小时内也显示出汇合曲线的斜率增加（与使用的掩模无关，60%，80%或100%， 图3A-C）。由于不同涂层在24小时的初始差异可能是由于细胞附着的差异，因此细胞生长已标准化为后期时间点（从48到120小时）的24小时（图3D-F）。使用60%、80%和100%掩模获得的图表显示，不同涂层之间的汇合度没有差异，LN-521观察到的差异很可能是由于iPSCs在传代时粘附在该涂层上的能力增强。
图1.3天后接种在不同ECM涂层上的iPSC的代表性明场图像和鬼笔环肽染色。明场图像显示细胞在所使用的涂层上是健康的，并且它们很好地附着在血管上，如鬼笔环肽染色所记录的那样，显示清晰可见的细胞骨架微丝。比例尺：25 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图2.具有代表性的明场图像显示了用于执行汇合分析的掩模的三种不同分析设置。使用明场图像（来自96孔板的16张图像/孔）使用细胞仪获得的马赛克。在绿色中，分析分割清楚地显示了应用的不同掩模（60，80 100%），以避免或包括孔的圆边缘。比例尺：500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3.接种在不同包被容器上的iPSC的细胞汇合分析。表示接种在不同包被的容器上的 iPSC 细胞汇合的图表。使用适当的软件使用（A）60%掩模（B）80%（C）100%采集5天（120小时）分析数据。48小时至120小时时间点到第一个时间点（24小时）汇合的归一化如图（D，E，F）所示。数据是从三个独立实验中获得的。数据表示为SEM±平均值。 n = 3 * p<0.05。请点击此处查看此图的大图。
| 涂料化合物 | 初始浓度 | 最终浓度 |
| HU-纤连蛋白 | 1毫克/毫升 | 10 微克/厘米2 |
| 层粘连蛋白521 | 100微克/毫升 | 20 微克/毫升 |
| 基质胶 | * | 0.111111111 |
| 玻连蛋白XF | 250微克/毫升 | 10微克/毫升 |
表 1. 用于分析汇合度的涂料化合物列表。 报告了所用不同涂层的名称、初始和最终浓度。* 基质胶的初始浓度因批次而异。
补充文件。请点击这里下载此文件。
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Discussion
使用iPSCs进行疾病建模和未来的药物筛选以及它们在精准医学中的可能应用使其成为一项具有重要意义的技术，因此我们认为有必要清楚地了解更类似于胚胎干细胞生理状况的体外培养条件。在这种情况下，我们使用野生型iPSCs测试了不同的ECM涂层，以了解允许细胞保持健康和未分化状态的条件。除此之外，一个关键点是在MEF和基质胶的异种成分中培养iPSC，这可能解释了一式三份之间的实验变异性，这阻碍了进行机理研究的能力26。
在这项研究中，我们使用高内涵图像分析仪细胞仪测试了iPSCs在无异种基因底物（即LN-521，玻连蛋白，Hu-纤连蛋白）上的汇合。使用自动图像分析系统的原因是，使用台盼蓝排除方法对细胞进行计数需要制造单细胞悬液，并且在操作iPSCs时不建议这样做，因为它们应该在细胞簇中繁殖以避免细胞死亡。通过高内涵图像分析获得的数据使我们能够跟踪细胞汇合而不会干扰细胞，因为它们每天简单地成像 5 天。该技术可被视为表征 iPSC 系的选择方法，并且可以包括它来执行人 iPSC 的质量控制。虽然我们使用的是商业软件包，但这里描述的方法可以通过等效的高内涵/高通量图像分析平台和类似的分析软件包成功使用。获得的数据表明，接种在LN-521上的iPSCs在培养5天内呈现线性汇合，而不会分裂细胞，因此是本研究中测试的最佳无异种底物。该协议的一个局限性是，需要将获得的结果标准化到第一个时间点，以考虑iPSC附着在不同底物上的差异。有趣的是，获得的数据很可能是由iPSCs对LN-521的细胞附着率增加驱动的。事实上，当对第一个时间点的结果进行归一化时，不同底物之间没有观察到差异。
基于该研究获得的结果，更好地了解多能干细胞的生物学，了解介导细胞 - ECM接触的主要细胞表面受体，并且可能负责维持其自我更新能力而不是自发分化为特定细胞类型。有趣的是，有研究表明，培养表面的基质弹性影响了对不同细胞类型的分化，这可能取决于激活与细胞类型特异性分化相关的一些细胞内细胞信号通路的细胞-ECM相互作用27。除此之外，Vigilante等人28 通过将计算方法与基因表达和细胞生物学数据集相结合，探索了遗传对iPSC行为变化的贡献。因此，Vigilante等人28 的工作是试图将遗传变异映射到表型变异的重大进展。这些研究可能会导致标准化方法的开发，用于根据未来在临床中可能使用的iPSCs实验进行iPSCs实验。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该研究得到了Bambino Gesù基金会和Ricerca Corrente（意大利卫生部）对C.C.的资助。 我们要感谢Enrico Bertini博士（神经科学系，神经肌肉和神经退行性疾病部门，分子医学实验室，Bambino Gesù儿童研究医院），Stefania Petrini博士（共聚焦显微镜核心设施，研究实验室，Bambino Gesù儿童研究医院），Giulia Pericoli（肿瘤血液学，基因和细胞治疗科，儿童研究医院Bambino Gesù） Roberta Ferretti（Bambino Gesù儿童研究医院肿瘤血液学、基因和细胞治疗科）进行科学讨论和技术帮助。玛丽亚·芬奇是“英国癌症儿童奖学金”的获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
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