Summary
Deze methode beschrijft een protocol voor eiwitextractpreparaat met hoge doorvoer uit Caenorhabditis elegans-monsters en daaropvolgende co-immunoprecipitatie.
Abstract
Co-immunoprecipitatiemethoden worden vaak gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen. Bevestiging van veronderstelde eiwit-eiwit interacties of identificatie van nieuwe kan onschatbare informatie over de functie van een eiwit van belang. Sommige van de traditionele methoden voor extractvoorbereiding vereisen vaak arbeidsintensieve en tijdrovende technieken. Hier wordt een aangepast extractvoorbereidingsprotocol met behulp van een kraalmolenhomogenisator en metalen kralen beschreven als een snel alternatief voor traditionele eiwitbereidingsmethoden. Deze extractpreparaatmethode is compatibel met downstream co-immunoprecipitatiestudies. Als voorbeeld werd de methode gebruikt om C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 en twee bekende ALG-1 interactors met succes te co-immunoprecipitaat: AIN-1 en HRPK-1. Dit protocol bevat beschrijvingen van het verzamelen van dierlijke monsters, het bereiden van extracten, het verduidelijken van extracten en eiwitimmunoprecipitatie. Het beschreven protocol kan worden aangepast om te testen op interacties tussen twee of meer endogene, endogene gelabelde of overexpressie C. elegans-eiwitten in verschillende genetische achtergronden.
Introduction
Het identificeren van de macromoleculaire interacties van een interessant eiwit kan de sleutel zijn om meer te weten te komen over de functie ervan. Immunoprecipitatie- en co-immunoprecipitatie-experimenten kunnen worden gebruikt om het volledige interactoom van een eiwit te identificeren via grootschalige proteomische benaderingen1 of om specifiek het vermogen van een eiwit om te coprecipitaten met een veronderstelde interactor te testen. Bij C. eleganszijn beide methoden met succes gebruikt om meer te weten te komen over de activiteit van een verscheidenheid aan eiwitten , waaronder die welke nauw samenwerken met microRNAs om genexpressie2,3,4te reguleren . Co-immunoprecipitatie-experimenten hebben het voordeel dat ze de eiwit-eiwitinteracties in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving testen, maar extractvoorbereiding kan uitdagend en tijdrovend zijn. Efficiënte lysis van het monster is noodzakelijk, maar er moet voor worden gezorgd dat de verstoring van eiwit-eiwitinteracties tot een minimum wordt beperkt. Methoden zoals douncing5,sonicatie6,Balch homogenisatie7,en zirkonia kralen-homogenisatie8,9 zijn gebruikt om met succes te bereiden C. elegans totale eiwitextracten. Deze methoden, met uitzondering van zirkonia kraal homogenisatie, hebben beperkingen in termen van het aantal monsters dat tegelijkertijd kan worden verwerkt. Gepresenteerd is een alternatieve methode die gemakkelijk kan worden opgeschaald om een snelle eiwitextractvoorbereiding met hoge doorvoer mogelijk te maken uit C. elegans-monsters, gevolgd door co-immunoprecipitatie. In het bijzonder kan de methode tot 24 monsters tegelijk bereiden, waardoor de tijd die nodig is voor het bereiden van extracten aanzienlijk wordt verkort. Douncing daarentegen maakt meestal slechts één monstervoorbereiding tegelijk mogelijk. Deze extractmethode kan worden gebruikt om extracten te bereiden uit elke ontwikkelingsfase van C. elegans.
Beschreven is een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van dierlijke monsters, extractvoorbereiding, immunoprecipitatie en presentatie van westerse blaasgegevens om succesvolle eiwituittrekkracht en detectie van het co-immunoprecipiterende eiwit van belang te bevestigen. Om de effectiviteit van het protocol aan te tonen, werden twee co-immunoprecipitatie-experimenten uitgevoerd tussen 1) microRNA Argonaute ALG-1 en AIN-1, een GW182 homolog; en 2) ALG-1 en HRPK-1, een nieuw geïdentificeerde ALG-1 interactor2. ALG-1 en AIN-1 zijn kerneiwitten die het microRNA-geïnduceerde geluiddempingscomplex (miRISC) omvatten en de interactie tussen deze twee eiwitten is goed ingeburgerd10,11. Het extractpreparaatprotocol was effectief in het ALG-1-AIN-1 co-immunoprecipitatie-experiment. Dit protocol bevestigde ook met succes de interactie tussen ALG-1 en zijn nieuw geïdentificeerde interactor, HRPK-12.
Samengevat beschrijft het manuscript een C. elegans extractpreparaatprotocol dat kan worden opgeschaald om tegelijkertijd 24 monsters te verwerken, samen met een co-immunoprecipitatieprotocol dat kan worden gebruikt om nieuwe of veronderstelde interacties tussen eiwitten te identificeren of te bevestigen. Het extractpreparaatprotocol is compatibel met een aantal downstream-experimenten, waaronder eiwitimmunoprecipitatie2 en microRNA pulldowns12. Bovendien kan het immunoprecipitatieprotocol worden aangepast om te testen op interacties tussen twee of meer endogene, endogene gelabelde of overexpressie C. elegans-eiwitten in verschillende genetische achtergronden.
Protocol
1. Wormmonsterverzameling
- Zaad gemengd stadium ofgesynchroniseerd 13 wormen op NGM vaste platen op de vereiste temperatuur en laat de wormen groeien tot de gewenste fase. Voor basisgroei en onderhoud van C. elegans, zie Stiernagle et al. en Porta-de-la-Riva et al.14,13.
- Verzamel wormen in een conische centrifugebuis van 15 ml door de wormplaten te wassen met een M9-buffer.
- Pellet de wormen door 400 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 minuten te centrifugeren en gooi het supernatant weg.
OPMERKING: De grootte van de wormkorrel voor de bereiding van extracten ligt tussen 100 μL en 500 μL. Een pellet van 300 μL verpakte wormen wordt aanbevolen voor downstream immunoprecipitatie-experimenten en levert meestal ~ 4,5 mg totaal eiwit op, terwijl een pellet van 500 μL ~ 7,5 mg totaal eiwit oplevert. - Voer extra 3-5 wasbeurten uit met M9-buffer (zie tabel 1)of totdat het supernatant niet langer troebel is.
- Voer nog een laatste wasbeurt uit met ddH2O.
- Verplaats de losse wormkorrel naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en draai gedurende 2 minuten bij RT bij 400 x g naar beneden. Gooi het resterende supernatant weg om een verpakte wormkorrel te verkrijgen en ga verder met het extraheren van de bereiding.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken. Wormkorrels kunnen onmiddellijk in vloeibare stikstof worden ingevroren en bij -80 °C of in vloeibare stikstof worden opgeslagen. Houd er rekening mee dat wormkorrels slechts één keer kunnen worden ontdooid en niet kunnen worden gerevrozen.
2. Extractpreparaat van de wormkorrel
OPMERKING: Het extractpreparaat moet op ijs of bij 4 °C worden uitgevoerd.
- Indien bevroren, ontdooi wormkorrel op ijs.
OPMERKING: Als de gewenste verpakte wormkorrelgrootte van 300 μL niet is verkregen tijdens het verzamelen van de monsters, kunnen meerdere kleinere pellets worden gecombineerd totdat er voldoende materiaal aanwezig is voor verdere extractie. - Voeg een gelijk volume ijskoude 2x lysisbuffer toe (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumchloride, 0,1% Triton X, 4 mM magnesiumchloride, 10% glycerol, 2 mM DTT met RNase-remmer, proteaseremmer en fosfataseremmers; zie tabel 1) en vortex of pipet op en neer om te mengen. Draai de buis(en) naar beneden om het mengsel aan de onderkant van de buis te verzamelen.
- Verplaats het mengsel in een RNase-vrije buis van 1,5 ml met metalen kralen (zie tabel met materialen)en plaats het monster in de homogenisator van de kraalmolen (zie tabel met materialen)bij 4 °C. Zorg ervoor dat de buisdoppen zijn vastgedraaid en dat de monsters in evenwicht zijn in de homogenisator.
- Homogeniseer het monster op de hoogste snelheid (instelling 12) gedurende 4 minuten.
- Verwijder het monster van de kralen en plaats het in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Als alternatief kan een magneet met de homogenisator worden gebruikt om de kralen uit het monster te verwijderen.
- Draai het extract bij 19.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het eiwitextract te verduidelijken.
- Breng het supernatant over in een verse buis van 1,5 ml op ijs, terwijl de overdracht van het witte, troebele neerslag dat zich bovenop het monster vormt, wordt vermeden. De supernatant is nu het geklaarde extract.
OPMERKING: Bewaar 10 μL van het geklaarde extract om de totale eiwitconcentratie te bepalen. - Gebruik het extract onmiddellijk voor de volgende experimenten of vries het extract in vloeibare stikstof in en bewaar het bij -80 °C.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken. Extracten kunnen worden bewaard bij ultralage temperatuur (-80 °C vriezer of vloeibare stikstof gedurende ~ 6 maanden). Bevroren extracten kunnen eenmaal ontdooid worden en kunnen niet worden gerevrozen. - Bepaal de totale eiwitconcentratie van het extract met behulp van een eiwitconcentratietestkit die compatibel is met detergentia (zie tabel met materialen)volgens de instructies van de fabrikant.
3. Immunoprecipitatie
OPMERKING: Alle immunoprecipitatiestappen voor extractvoorbereiding moeten worden uitgevoerd op ijs of bij 4 °C. Het wordt aanbevolen om 2 mg totaal eiwit te gebruiken voor elke immunoprecipitatie. Echter, succesvolle immunoprecipitaties met 0,8-1 mg van het totale eiwit zijn uitgevoerd. Gebruik altijd verse of vers ontdooide eiwitextracten. Het volgende protocol wordt beschreven om immunoprecipitatie uit te voeren van 2 mg totaal eiwit, of een enkel immunoprecipitatie-experiment. De hoeveelheid kralen en antilichamen kan dienovereenkomstig worden verhoogd of verlaagd voor meerdere monsters of als een andere hoeveelheid eiwitextract wordt gebruikt.
- Plaats of ontdooi het eiwitextract op ijs. Het monster kan worden verdund tot 10 mg/ml of 5 mg/ml met ijskoude 1x lysisbuffer (zie tabel 1).
- Resuspend de magnetische kralen door inversie en breng 150 μL van de 50% kralen suspensie in een 1,5 ml buis. Magnetiseer de kralen op ijs tegen een magneetstandaard gedurende 1 min of totdat de oplossing helder is. Gooi het supernatant weg.
- Verwijder de buis van de magnetische standaard en was de kralen in 1x lysisbuffer met 2 volumes (d.w.z. 300 μL) kraalmest. Herhaal de was 2x voor in totaal drie wasbeurten.
- Resuspend de kralen in 150 μL ijskoude lysisbuffer.
- Breng 75 μL van de kraalmest over op 2 mg eiwitextract en incubeer bij 4 °C gedurende 1 uur met zachte agitatie. Bewaar de resterende kraalsuspensie op ijs voor later gebruik.
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om de niet-specifieke eiwitbinding aan kralen tijdens de immunoprecipitatiestap te verminderen. - Plaats de buis met monster op de magnetische standaard op ijs gedurende 1 min of totdat de kralen volledig gemagnetiseerd zijn en het monster helder is. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 ml; verstoor de kralen niet. Dit is het precleared eiwitlysaat. Bespaar 10% van het monster voor westerse vlekanalyse.
- Voeg 20 μg affiniteit gezuiverd antilichaam toe aan het voorcleared lysaat en incubeer bij 4 °C gedurende 1 uur met zachte agitatie.
OPMERKING: De hoeveelheid antilichamen die wordt gebruikt voor immunoprecipitatie is specifiek voor het antilichaam en het eiwit en moet empirisch worden bepaald om een effectieve immunoprecipitatie van het doeleiwit te garanderen. - Voeg de resterende 75 μL van de voorgewassen kralensuspensie (stap 3.5) toe aan het antilichaam/lysaatmengsel en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C met zachte agitatie.
- Plaats de buis in de magnetische standaard op ijs gedurende 1 min of totdat de kralen volledig gemagnetiseerd zijn en het monster helder is. Bewaar het supernatant voor western blot analyse (optioneel).
- Was de kralen met het immunoprecipitaat 3x in 450 μL wasbuffer (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumchloride, 0,1% Triton X, 2 mM magnesiumchloride, 10% glycerol, 1 mM DTT; zie tabel 1) op ijs.
OPMERKING: Extra wasbeurten kunnen worden uitgevoerd als strengere wasomstandigheden de voorkeur hebben. - Resuspend de kraalkorrel in 20 μL 2x SDS/BME eiwitgellaadbuffer (zie tabel met materialen) en denature door 5 minuten te koken bij 95 °C voordat deze op een SDS-PAGE gel wordt geladen. Als alternatief kunnen gedenatureerde monsters enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
OPMERKING: Een deel van het adal immunoprecipitaat kan worden opgeslagen voor downstream RNA-isolatie, indien gewenst.
4. Westerse vlekdetectie van IP-monsters
- Plaats de IP-monsters op de SDS-PAGE gel (zie Materiaaltabel). Vermijd het overbrengen van de kralen door de IP-buizen gedurende 1 minuut op de magnetische standaard te plaatsen voordat u het monster aspireert.
- Voer de Western blotting15,16 en antilichaamkleuring16 uit met de volgende wijzigingen: verdun het ALG-1-antilichaam17 1:500 in 5% vetvrije droge melk (NFDM); verdun het HRPK-1 antilichaam2 1:1.000 in 5% NFDM; en verdun het AIN-1 antilichaam18 1:10.000 in 5% NFDM. Secundaire antilichamen (zie tabel met materialen)werden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.
- Detecteer de banden met op HRP gebaseerde chemiluminescentie (zie tabel met materialen).
Representative Results
Dit protocol (schematisch weergegeven in figuur 1) werd met succes gebruikt om C. elegans totale eiwitextracten (figuur 2) te verkrijgen voor downstream immunoprecipitatie van verschillende eiwitten2 (figuur 3 en figuur 4). Het gepresenteerde homogenisatorprotocol voor kraalmolens was qua totale eiwitextractie vergelijkbaar met dounce-gebaseerde methoden (figuur 2) en efficiënt geëxtraheerd nucleair (COL-19::GFP(NLS) (figuur 2) en cytoplasmatische eiwitten (figuur 3 en figuur 4). Meerdere monsters van verschillende grootte werden tegelijkertijd geëxtraheerd (figuur 2). Argonaute-eiwitten interageren met leden van de GW182-eiwitfamilie en vormen de miRISCs die zich binden aan de doelboodschapper RNA's en hun expressie onderdrukken10. Figuur 3 toont succesvolle co-immunoprecipitatie van de kernmiRISC-componenten ALG-1 en AIN-1, in overeenstemming met eerdere rapporten11,17. Meer recentelijk werden inspanningen geleverd om extra eiwit interactoren van Argonaute ALG-13 te identificeren om meer te weten te komen over hoe microRNA biogenese en activiteit kunnen worden gereguleerd door hulpfactoren. Het RNA-bindende eiwit HRPK-1 werd geïdentificeerd in ALG-1 immunoprecipitaten3. Deze interactie werd onlangs bevestigd in een wederkerig HRPK-1 immunoprecipitatie-experiment2. Het gepresenteerde extract en immunoprecipitatieprotocollen herstelden met succes ALG-1 in HRPK-1-specifieke co-immunoprecipitaten (Figuur 4). Bovendien werd de ALG-1-AIN-1 interactie getest op verschillende genetische achtergronden en HSPK-1 bleek niet nodig te zijn voor de ALG-1/AIN-1 miRISC assemblage2 (Figuur 3). Aanvullende cijfers worden verstrekt om het volledige onderzochte membraan weer te geven (Aanvullende figuur 1).
Figuur 1: Workflow schematisch voor C. elegans extract voorbereiding en immunoprecipitatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Westerse vlekvergelijking van een nucleair gelokaliseerd GFP, COL-19::GFP(NLS), niveaus in dounce-bereide en gehomogeniseerde monsters van 250 μL en 100 μL wormkorrels. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: GW182 homolog AIN-1 co-immunoprecipitaten met ALG-1. Westerse blotting voor ALG-1 en AIN-1 eiwitten in ALG-1 immunoprecipitaten. De ALG-1/AIN-1 co-immunoprecipitatie werd niet beïnvloed door de afwezigheid van hrpk-1. Input = 10% van IP. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: ALG-1 co-immunoprecipitaten met HRPK-1. Western blotting voor HRPK-1 en ALG-1 bij HRPK-1 immunoprecipitaten wordt getoond. Input = 10% van IP. * duidt op antilichaam zware ketting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| M9 buffer (1 L) | |
| KH2PO4 | 3 g |
| Na2HPO4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| 1 M MgSO4 | 1 ml |
| ddH2O | tot 1 L |
| 2x Lysis buffer (5 ml) | |
| HEPES (pH 7,4) | 200 μL |
| 2 M KCl | 250 μL |
| 10% TritonX | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% glycerol | 1 ml |
| ddH2O | tot 5 ml |
| Voeg vers toe: | |
| 1 M DTT | 20 μL |
| EDTA-vrije proteaseremmer | 1 tablet |
| fosfataseremmer cocktail 2 | 100 μL |
| fosfataseremmer cocktail 3 | 100 μL |
| 1x Lysis buffer | |
| Verdun 2x Lysis buffer met een gelijk volume ddH20. | |
| 1x Wasbuffer 10 ml) | |
| HEPES (pH 7,4) | 300 μL |
| 2 M KCl | 500 μL |
| 10% TritonX | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% glycerol | 1 ml |
| ddH2O | tot 10 ml |
| 1 M DTT | 20 μL (vers toevoegen) |
Tabel 1: Recepten
Aanvullend figuur 1. Volledige onderzochte westerse vlekkenmembranen die worden gebruikt om figuren 2-4 te genereren, worden weergegeven. (A) Onderzocht membraan voor figuur 2. Merk op dat het membraan is gesneden om gelijktijdige tasten voor GFP en Tubulin mogelijk te maken, waardoor de totale vlekgrootte wordt verminderd. B) Onderzocht membraan voor figuur 3. (C) Onderzocht membraan voor figuur 3. *duidt op antilichaam zware ketting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
C. elegans is een uitstekend model voor het bestuderen van fundamentele vragen in cel-, moleculaire en ontwikkelingsbiologie19. Naast zijn kracht als genetisch modelsysteem, is C. elegans vatbaar voor biochemische benaderingen, waaronder, maar niet beperkt tot, eiwit immunoprecipitatie en co-immunoprecipitatie. Een mogelijke hindernis bij het uitvoeren van immunoprecipitatie-experimenten is het ontbreken van antilichamen die specifiek zijn voor de eiwitten van belang. Als er geen antilichamen beschikbaar zijn, kunnen aangepaste polyklonale of monoklonale antilichamen worden gegenereerd. Recente innovaties in genoombewerkingstechnologie hebben onderzoekers echter in staat gesteld om snel mutaties te introduceren of endogene C. elegans-genen 20,21tetaggen , waardoor studies mogelijk zijn die de genetische, functionele en fysieke interacties tussen de genen en de gecodeerde eiwitten ontrafelen. Met name crispr/cas9-gemedieerde tagging van C. elegans genen op de endogene loci heeft de afhankelijkheid van immunoprecipitatie experimenten op de beschikbaarheid van antilichamen verminderd, waardoor co-immunoprecipitatie experimenten veel haalbaarder zijn geworden. C. elegans genen kunnen worden getagd met een verscheidenheid aan tags, variërend van fluorescerende tags zoals GFP of mCherry tot kleine tags zoals FLAG en HA. Antilichamen die deze tags herkennen, zijn direct commercieel beschikbaar, waardoor de studies naar eiwit-eiwitinteracties via immunoprecipitatiebenaderingen worden vergemakkelijkt.
Het gepresenteerde protocol, beschreven in figuur 1,kan worden uitgevoerd voor een klein aantal monsters of worden opgeschaald, waardoor maximaal 24 monsterpreparaten tegelijk mogelijk zijn. Hoewel de eerste karakteriseringen van eiwit-eiwitinteracties via immunoprecipitatie meestal worden gedaan in wilde typeachtergronden onder normale groeiomstandigheden, vereisen vervolgstudies vaak het testen van de eiwit-eiwitinteracties in verschillende genetische achtergronden of onder verschillende groeiomstandigheden. De mogelijkheid om tegelijkertijd meerdere extracten te bereiden bespaart tijd en, belangrijker nog, zorgt voor consistentie van de extractvoorbereiding tussen de verschillende monsters. Een negatieve controle is altijd vereist, waarbij de ideale controle een nulmutatie is in de gencodering voor het immunoprecipiteerde eiwit van belang (zie figuur 3 en figuur 4 voor voorbeelden).
Dit extractprotocol maakt een snelle bereiding van eiwitextracten uit C. elegans-monsters mogelijk en is vergelijkbaar met homogenisatie op basis van zirkoniumkraal8. Kraalhomogenisatie in het algemeen kan worden opgeschaald naar meerdere gelijktijdige monsterpreparaten met behulp van een verscheidenheid aan kraalmolenhomogenisatoren of soortgelijke apparatuur. Sommige zuinigere kraalmolenhomogenisatoren kunnen echter het aantal monsters verminderen dat tegelijkertijd kan worden verwerkt. Als alternatief is het gepresenteerde extractprotocol compatibel met extractpreparaat op basis van dounce, wat een economisch alternatief is. Hoewel verschillende kraalmolenhomogenisatoren niet werden getest, zijn de meeste waarschijnlijk compatibel met dit eiwitextractprotocol, zolang volledige verstoring van de C. elegans-monsters wordt bereikt.
Zoals gepresenteerd, dit extract voorbereiding protocol is compatibel met meerdere downstream experimenten, met inbegrip van eiwit immunoprecipitatie2 en microRNA pull-down12 en maakt het mogelijk voor downstream verzameling van zowel eiwit en RNA componenten. Het extraheert ook efficiënt zowel nucleaire als cytoplasmatische eiwitten (figuur 2, figuur 3en figuur 4). Evenzo maakt het gepresenteerde immunoprecipitatieprotocol RNA-isolatie van eiwitgerelateerde immunoprecipitaten mogelijk. Terwijl het immunoprecipitatieprotocol oorspronkelijk werd ontwikkeld om ALG-1 eiwitinteracties te identificeren, kan de methode worden aangepast om te testen op interacties tussen alle eiwitten van belang. In feite werkten de gebruikte immunoprecipitatieomstandigheden even goed voor immunoprecipiterende ALG-1 (figuur 3) en HRPK-1 (figuur 4). Dit protocol is een uitstekend uitgangspunt voor immunopurificatie van RNA-bindende eiwitten. Er zij echter op gewezen dat sommige veranderingen in de buffersamenstelling nodig kunnen zijn voor andere eiwitten van belang. De veranderingen kunnen afhangen van de fysische en biochemische eigenschappen van het eiwit van belang en moeten van geval tot geval worden geïmplementeerd.
Zodra het doeleiwit (hier, ALG-1 of HRPK-1) immunoprecipitated is, kan western blotting worden gebruikt om het co-immunoprecipitaat te testen op specifieke eiwit interactoren.
Als alternatief kan het gecopureerde immunoprecipitaat worden onderworpen aan massaspectrometrieanalyse om alle putatieve interacterende eiwitten te identificeren. Bevestigde co-immunoprecipitatie interacties kunnen vervolgens worden onderzocht in een verscheidenheid van genetische achtergronden of voorwaarden om potentiële regulering van de specifieke interactie te identificeren. Om bijvoorbeeld te bepalen of hrpk-1 een rol speelt in alg-1/AIN-1 miRISC assemblage, werd ALG-1-AIN-1 coprecipitatie beoordeeld zowel op een wilde type achtergrond als bij afwezigheid van HRPK-1 (Figuur 3). hrpk-1 bleek overbodig te zijn voor ALG-1/AIN-1 interactie2 (figuur 3). Bovendien kan CRISPR/Cas9 genoombewerkingstechnologie worden gebruikt om mutaties met één punt of domeinverwijdering in de eiwitten van belang te genereren. Het opnieuw testen van het vermogen van de gegenereerde mutanten om te coprecipitaten met hun eiwitinteracties kan onthullen welke domeinen of residuen de fysieke interactie bemiddelen. Dergelijke toekomstige studies kunnen onschatbare informatie opleveren over het mechanisme van eiwitfunctie en -regulering. Deze benaderingen, gecombineerd met de kracht van C. elegans genetica, kunnen belangrijke inzichten bieden in de fundamentele moleculaire processen die de ontwikkeling van dieren en cellulaire functie bepalen.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Kansas INBRE, P20GM103418 aan Li en Zinovyeva en R35GM124828 aan Zinovyeva. We danken Min Han voor het royaal delen van het anti-AIN-1 antilichaam. Sommige van de stammen die in de loop van dit werk werden gebruikt, werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
References
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
