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Medicina

Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon

Published: August 01, 2020
doi:
10.3791/61278
, , , , , , ,
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School,University of Western Australia

Summary

Un système biréacteur de stimulation mécanique uniaxial en trois dimensions est un bioréacteur idéal pour la différenciation ténogénique spécifique des cellules souches dérivées du tendon et de la formation de néo-tendons.

Abstract

La tendinopathie est une maladie chronique commune de tendon relative à l’inflammation et à la dégénérescence dans une zone orthopédique. Avec une morbidité élevée, une capacité d’auto-réparation limitée et, surtout, aucun traitement définitif, la tendinopathie influence encore négativement la qualité de vie des patients. Les cellules souches dérivées du tendon (TDSC), en tant que cellules précurseurs primaires des cellules du tendon, jouent un rôle essentiel dans le développement de la tendinopathie, et la restauration fonctionnelle et structurelle après tendinopathie. Ainsi, une méthode qui peut in vitro imiter la différenciation in vivo des TDSCs en cellules de tendon serait utile. Ici, le présent protocole décrit une méthode basée sur un système d’étirement uniaxial tridimensionnel (3D) pour stimuler les TDSC à se différencier en tissus semblables à des tendons. Il y a sept étapes du protocole actuel : isolement des souris TDSCs, culture et expansion des souris TDSCs, préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellules, formation de feuille cellulaire par culture dans le milieu de stimulation, préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement, et évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro de tendon-comme. L’efficacité a été démontrée par l’histologie. L’ensemble de la procédure prend moins de 3 semaines. Pour favoriser le dépôt extracellulaire de matrice, l’acide ascorbique de 4.4 mg/mL a été employé dans le milieu de culture de stimulation. Une chambre séparée avec un moteur linéaire fournit une charge mécanique précise et est portable et facilement ajusté, qui est appliqué pour le bioréacteur. Le régime de chargement dans le protocole actuel était de 6% souche, 0,25 Hz, 8 h, suivie de 16 h de repos pendant 6 jours. Ce protocole pourrait imiter la différenciation cellulaire dans le tendon, ce qui est utile pour l’étude du processus pathologique de tendinopathie. En outre, le tissu tendon-like est potentiellement utilisé pour favoriser la guérison du tendon dans les blessures du tendon comme une greffe autologue ingénieur. En résumé, le protocole actuel est simple, économique, reproductible et valide.

Introduction

La tendinopathie est l’une des blessures sportives courantes. Il se manifeste principalement par la douleur, l’enflure locale, la tension musculaire diminuée dans la zone affectée, et le dysfonctionnement. L’incidence de la tendinopathie est élevée. La présence de tendinopathie d’Achille est plus fréquente chez les coureurs de moyenne et longue distance (jusqu’à 29 %), tandis que la présence de tendinopathie patellaire est également élevée chez les athlètes de volley-ball (45 %), de basket-ball (32 %), d’athlétisme (23 %), de handball (15 %) et de soccer(13%) 1,2,3,,4,,5. Cependant, en raison de la capacité d’auto-guérison limitée du tendon, et l’absence de traitements efficaces, tendinopathie influence encore la vie des patients négativement6,7. En outre, la pathogénie de la tendinopathie reste peu claire. Il ya eu de nombreuses enquêtes sur sa pathogénie, principalement y compris la « théorie de l’inflammation », « théorie de la dégénérescence », « théorie de la surutilisation », et ainsi de suite8. À l’heure actuelle, de nombreux chercheurs croyaient que la tendinopathie était due à l’auto-réparation ratée aux micro-blessures causées par une charge mécanique excessive le tendon éprouve9,10.

Les cellules souches dérivées du tendon (TDSC), en tant que cellules précurseurs primaires des cellules du tendon, jouent un rôle essentiel dans le développement de la tendinopathie et dans la restauration fonctionnelle et structurelle après tendinopathie11,12,13. Il a été rapporté que la stimulation mécanique de contrainte pourrait causer la prolifération et la différenciation des ostéocytes, des ostéoblastes, des cellules musculaires lisses, des fibroblastes, des cellules souches mésenchymales et d’autres cellules sensibles à la force14,15,16,17,18. Par conséquent, les TDSC, en tant que l’une des cellules mécanosensibles et multipotentes, peuvent également être stimulées à différencier par chargement mécanique19,20.

Toutefois, différents paramètres de chargement mécanique (résistance au chargement, fréquence de chargement, type de chargement et période de chargement) peuvent inciter les TDSC à se différencier en différentes cellules21. Ainsi, un régime de chargement mécanique efficace et valide est très important pour la tenogenèse. En outre, il existe différents types de bioréacteurs que les systèmes de stimulation actuellement utilisés pour fournir le chargement mécanique aux TDSC. Les principes de chaque type de bioréacteur sont différents, de sorte que les paramètres de chargement mécanique correspondant à différents bioréacteurs sont également différents. Par conséquent, un protocole de stimulation simple, économique et reproductible est en demande, y compris le type de bioréacteur, le milieu de stimulation correspondant et le régime de chargement mécanique.

Le présent article décrit une méthode basée sur un système d’étirement uniaxial tridimensionnel (3D) pour stimuler les TDSC à se différencier en tissu tendinaire. Il y a sept étapes du protocole : isolement des souris TDSCs, culture et expansion des souris TDSCs, préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellules, formation de feuille de cellules par culture dans le milieu de stimulation, préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement, et évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro de tendon-comme. L’ensemble de la procédure prend moins de 3 semaines pour obtenir la construction de cellules 3D, ce qui est beaucoup moins que certaines méthodes existantes22,23. Le protocole actuel s’est avéré être capable d’inciter les TDSC à se différencier en tissu de tendon, et il est plus fiable que le système d’étirement bidimensionnel (2D) couramment utilisé (2D)courant 21. L’efficacité a été démontrée par l’histologie. En bref, le protocole actuel est simple, économique, reproductible et valide.

Protocol

Les méthodes décrites ont été approuvées et exécutées conformément aux lignes directrices et règlements du Comité d’éthique animale de l’Université d’Australie-Occidentale. 1. Isolement des souris TDSCs Euthanasier les souris C57BL/6 de 6-8 semaines par dislocation cervicale. Moisson tendons rotuleux24 et tendons d’Achille25. Digest tendons de l’un avec 6 mL de collagènease de type I (3 mg/mL) …

Representative Results

Avant la stimulation mécanique, les TDSC étaient cultivés à 100% confluent dans un milieu complet et affichaient une morphologie ultrastructurale désorganisée (figure 2A). Après 6 jours de chargement mécanique uniaxial d’étirement, la matrice extracellulaire (ECM) et les alignements cellulaires étaient bien orientés (figure 2B). Les cellules étaient bien peuplées et bien enveloppées dans ecm après chargement mécanique. La morphologie cellulaire a été présentée pour …

Discussion

Le tendon est un tissu conjonctif fibreux mécanosensible. Selon des recherches antérieures, l’excès de charge mécanique pourrait conduire à la différenciation ostéogénique des cellules souches du tendon, alors qu’une charge insuffisante conduirait à une structure désordonnée de fibres de collagène au cours de la différenciation destendons 21.

Un point de vue commun est que la clé d’un bioréacteur idéal est la capacité de simuler le microenvironnem…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche a été réalisée alors que l’auteur recevait « une bourse d’études internationales de l’Université d’Australie-Occidentale et un prix universitaire de troisième cycle à l’Université d’Australie-Occidentale ». Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331
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Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).
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