החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד
Summary
תלת-מימדי גירוי מכני מכאני מערכת ביוריאקטור הוא ביווריקטור אידיאלי עבור הבחנה מסוימת של הבידול בתאי גזע הנגזר גיד והיווצרות גיד ניאו.
Abstract
טדינופתיה היא מחלת גיד כרונית נפוצה הנוגעת לדלקת וניוון באזור אורתופדיות. עם תחלואה גבוהה, יכולת לתיקון עצמי מוגבל, והכי חשוב, אין טיפולים מוחלט, הטדינפתיה עדיין משפיע על איכות החיים של המטופלים שלילית. גיד-בתאי גזע נגזר (TDSCs), כמו התאים הראשוניים העיקרי של תאים גיד, לשחק תפקיד חיוני הן בפיתוח של הטדינפתיה, ושחזור פונקציונלי ומבניים לאחר הטנופתיה. כך, שיטה שיכולה בתוך מבחנה לחקות את הבידול vivo של TDSCs לתוך תאים גיד יהיה שימושי. כאן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המבוססת על תלת מימדי (3D) מערכת מתיחה uniaxial כדי לעורר את TDSCs להבדיל לרקמות כמו גיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול הנוכחי: בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת התרבות גירוי בינונית עבור היווצרות הגיליון התא, גיליון התא היווצרות על-ידי culturing במדיום גירוי, הכנת תא גזע 3D בניית תאים, הרכבה של מתיחה uniaxial מותח מורכב גירוי מכני, הערכה של האפקטיביות הוכח על ידי היסטולוגיה. ההליך כולו לוקח פחות מ 3 שבועות. כדי לקדם את התצהיר של מטריקס מטריתאי, 4.4 mg/mL חומצה אסקורבית שימש במדיום תרבות גירוי. חדר מופרד עם מנוע לינארי מספק טעינה מכנית מדויקת והוא נייד ומותאם בקלות, אשר מוחל על הביוריאקטור. משטר ההעמסה בפרוטוקול הנוכחי היה 6% זן, 0.25 Hz, 8 h, ואחריו 16 h מנוחה עבור 6 ימים. פרוטוקול זה יכול לחקות בידול התא בגיד, אשר מועיל לחקירה של התהליך הפתולוגי של הטדינופתיה. יתר על כן, הרקמה כמו גיד משמש פוטנציאל לקדם ריפוי גיד בפגיעת גיד כשתל אוטוולוגי הנדסה. כדי לסכם, הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט, כלכלי, מתוכולל ותקף.
Introduction
טדינפתיה היא אחת מפציעות הספורט השכיחות. הוא מתבטא בעיקר על ידי כאב, נפיחות מקומית, הופחת מתח שרירים באזור המושפע, ותפקוד לקוי. השכיחות של הטדינופתיה הוא גבוה. הנוכחות של אכילס טאננופתיה היא הנפוצה ביותר עבור רצים באמצע ובמרחק ארוך (עד 29%), בעוד הנוכחות של הפצ’יני טאננופתיה הוא גם גבוה בספורטאים של כדורעף (45%), כדורסל (32%), מסלול ושדה4,5(23%), כדוריד(15%),וכדורגל(13%),2,,3, עם זאת, בשל יכולת הריפוי העצמי המוגבלת של הגיד, והיעדר טיפולים יעילים, הטדינפתיה עדיין משפיע על החיים של המטופלים באופן שלילי6,7. יתר על כן, הפתוגנזה של טדינופתיה נשאר ברור. היו חקירות רבות על הפתוגנזה שלה, בעיקר כולל “תורת הדלקות”, “תורת הניוון”, “תאוריית שימוש יתר”, וכן הלאה8. כיום, חוקרים רבים האמינו כי tendinopathy היתה בשל התיקון העצמי כישלון לפציעות מיקרו מוגברת שנגרמו על ידי מכני מוגזם טוען את חווה9,10.
בתאי גזע נגזר של גיד (TDSCs), כמו התאים הראשוניים העיקרי של תאים גיד, לשחק תפקיד חיוני הן בפיתוח של tendinopathy ושחזור פונקציונלי ומבניים לאחר הטאננופתיה11,12,13. זה דווח כי גירוי מכני הלחץ יכול לגרום התפשטות והבידול של אוסטאופציטים, אוסטאופתית, תאי שריר החלקה, השרירים, בתאי גזע mesenchymal ותאים אחרים רגישים כוח14,15,16,17,18. לפיכך, TDSCs, כאחד התאים המכניים והחזקים ביותר, ניתן בדומה לגירוי להבדיל19באמצעות טעינהמכנית 19,20.
עם זאת, פרמטרים שונים של טעינה מכנית (כוח טעינת, תדירות טעינת, סוג טעינה ותקופת טעינה) יכול לגרום TDSCs להבדיל לתאים שונים21. לכן, משטר העמסה אפקטיבי ותקף מכני הוא משמעותי מאוד עבור tenogenesis. יתר על כן, ישנם סוגים שונים של ריאקטורים כמו מערכות גירוי המשמשים כיום לאספקת העמסה מכני TDSCs. העקרונות של כל סוג של ביוריאקטור חקן הם שונים, כך הפרמטרים ההעמסה מכני המתאימים ביוריאקטורים שונים הם גם שונים. לכן, פרוטוקול גירוי פשוט, כלכלי ומתכלה הוא ביקוש, כולל סוג הביוריאקטור, מדיום הגירוי המקביל ומשטר ההעמסה המכני.
המאמר הנוכחי מתאר שיטה המבוססת על תלת מימדי (3D) מערכת מתיחה uniaxial כדי לעורר את TDSCs להבדיל רקמות כמו גיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול: בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת התרבות גירוי בינונית עבור היווצרות הגיליון התא, גיליון התא היווצרות על-ידי culturing במדיום גירוי, הכנת תא גזע 3D בניית התא, הרכבה של מתיחה מכני מערכת גירוי מכאני, והערכה של גירוי מכני ההליך כולו לוקח פחות מ 3 שבועות כדי להשיג את המבנה תא תלת-ממד, אשר הרבה פחות מאשר כמה שיטות קיימות22,23. הפרוטוקול הנוכחי הוכח להיות מסוגל לגרום TDSCs להבדיל רקמת גיד, וזה יותר אמין מאשר דו מימדי הנוכחי בשימוש דו-ממדי (2D) מערכת מתיחה21. האפקטיביות הוכח על ידי היסטולוגיה. בקיצור, הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט, כלכלי, מתוכולל ותקף.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הגיד הוא רקמת חיבור סיבי מכונאי על פי המחקר הקודם, הטעינה מכני עודף עלול להוביל הבידול אוסטגניים של תאי גזע גיד, בעוד טעינה מספקת יוביל מבנה סיבים מחוסר סדר קולגן במהלך בידול הגיד21.
השקפה משותפת היא כי המפתח ביוריאקטור אידיאלי הוא היכולת לדמות את הסביבה מיקרו ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר בוצע בזמן המחבר היה לקבלה של “אוניברסיטת מערב אוסטרליה מלגת הבינלאומי מלגות ופרס לתואר שני באוניברסיטה באוניברסיטת אוסטרליה המערבית”. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81802214).
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
| Histology processor | Leica | TP 1020 | |
| Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
| Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
| Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
| Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
| Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |
Referências
- Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
- Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
- Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper’s knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
- Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper’s knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
- van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
- Lopez, R. G. L., Jung, H. -. G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
- Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), 245-251 (2001).
- Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), 508-521 (2006).
- Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
- Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
- Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
- Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
- Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
- Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
- Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
- Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
- Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), 014109 (2016).
- Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
- Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
- Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
- Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
- Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
- Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
- Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
- Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
- Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
- Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
- Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
- Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), 2697-2708 (2007).
- Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
- Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
- Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
- Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
- Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
- Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
- Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
- Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
- Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
- Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
- Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
- Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
- Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
- Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, 33-38 (2008).
- Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, 51-55 (2008).
- Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).
