Summary
Aquí se presentan métodos para comprender los efectos anticancerígenos del sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS). Las líneas celulares de cáncer colorrectal muestran muertes celulares cuando se tratan con LCFS en cultivos 3D. El proceso de generación de esferoides se puede optimizar dependiendo del andamio y los métodos de análisis presentados son útiles para evaluar las vías de señalización involucradas.
Abstract
Este manuscrito describe un protocolo para evaluar las muertes de células cancerosas en esferoides tridimensionales (3D) de tipos multicelulares de células cancerosas utilizando sobrenadantes del cultivo celular de Lactobacillus fermentum, considerados como cultivos probióticos. El uso de cultivos 3D para probar el sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS) es una mejor opción que las pruebas en monocapas 2D, especialmente porque L. fermentum puede producir efectos anticancerígenos dentro del intestino. Se identificó que el sobrenadante L. fermentum posee un aumento de los efectos antiproliferativos contra varias células de cáncer colorrectal (CCR) en condiciones de cultivo 3D. Curiosamente, estos efectos estaban fuertemente relacionados con el modelo de cultivo, demostrando la notable capacidad de L. fermentum para inducir la muerte de las células cancerosas. Se generaron esferoides estables a partir de diversos RC (células de cáncer colorrectal) utilizando el protocolo que se presenta a continuación. Este protocolo de generación de esferoides 3D ahorra tiempo y es rentable. Este sistema fue desarrollado para investigar fácilmente los efectos anticancerígenos de LCFS en múltiples tipos de esferoides CRC. Como era de esperar, los esferoides del CCR tratados con LCFS indujeron fuertemente la muerte celular durante el experimento y expresaron marcadores moleculares específicos de apoptosis analizados por qRT-PCR, western blotting y análisis FACS. Por lo tanto, este método es valioso para explorar la viabilidad celular y evaluar la eficacia de los medicamentos contra el cáncer.
Introduction
Los probióticos son los microorganismos más ventajosos en el intestino que mejoran la homeostasis inmune y el metabolismo energético del huésped1. Los probióticos de Lactobacillus y Bifidobacterium son los más avanzados de su tipo que se encuentran en el intestino2,3. Investigaciones anteriores han demostrado que Lactobacillus tiene efectos inhibitorios y antiproliferativos en varios tipos de cáncer, incluido el cáncer colorrectal4. Además, los probióticos previenen las enfermedades inflamatorias intestinales, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa5,6. Sin embargo, la mayoría de los estudios con probióticos se realizaron en monocapas bidimensionales (2D) que se cultivan en superficies sólidas.
Los sistemas de cultivo artificial carecen de características ambientales, lo que no es natural para las células cancerosas. Para superar esta limitación, se han desarrollado sistemas de cultivo tridimensionales (3D)7,8. Las células cancerosas en 3D muestran mejoras en términos de mecanismos biológicos básicos, como la viabilidad celular, la proliferación, la morfología, la comunicación célula-célula, la sensibilidad a los medicamentos y la relevancia in vivo9,10. Además, los esferoides están hechos de tipos multicelulares de cáncer colorrectal y dependen de las interacciones célula-célula y de la matriz extracelular (ECM)11. Nuestro estudio anterior ha informado que el sobrenadante probiótico libre de células (SFC) producido con Lactobacillus fermentum mostró efectos anticancerígenos en cultivos 3D de células de cáncer colorrectal (CCR)12. Propusimos que el SFC es una estrategia alternativa adecuada para probar los efectos probióticos en los esferoides 3D12.
Aquí, presentamos un enfoque que puede acomodar tipos multicelulares de cáncer colorrectal 3D para el análisis de los efectos terapéuticos del sobrenadante libre de células probióticas (SFC) en varios sistemas de imitación del cáncer colorrectal 3D. Este método proporciona un medio para el análisis de los efectos probióticos y anticancerígenos relacionados in vitro.
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Protocol
1. Cultivos celulares bacterianos y preparación de sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS)
NOTA: Los pasos 1.2 – 1.9 se llevan a cabo en una cámara anaeróbica.
- Prepare un plato de agar MRS y un caldo que contenga L-cisteína y esterilize en autoclave.
- Preincubar la placa de agar MRS en cámara anaeróbica H2 mantenida a 37 °C con 20 ppm de oxígeno.
- Descongelar la población bacteriana de Lactobacillus e inocular la placa de agar con el cultivo bacteriano (Figura 1A (i)).
- Incubar bacterias durante 2 - 3 días en cámara anaeróbica H2 a 37 °C y 20 ppm de oxígeno hasta obtener colonias bacterianas individuales.
- Lavar y secar el tubo de cultivo anaeróbico tipo Hungate. Autoclave el tubo de cultivo a 121 °C durante 15 min.
- Luego incube el tubo en la cámara anaeróbica H2 a 37 ° C y 20 ppm de oxígeno para eliminar el oxígeno.
- Coloque 2 - 3 ml de caldo MRS en el tubo. Selle el tubo con un tapón de goma de butilo y atornille la tapa.
- Obtener una sola colonia con un bucle y colocarla en el tubo de cultivo de 1,5 mL con 500 μL de 1x PBS. (Figura 1A (ii)).
- Suspender la colonia usando una jeringa de 1 ml (Figura 1A (iii)). Haga esto insertando la aguja de la jeringa de 1 ml en el centro de la tapa del tubo, aspirando la colonia suspendida y luego volvándola a suspender en el medio de caldo MRS. (Figura 1A (iv)).
- Incubar el medio de caldo MRS en una incubadora agitador durante 2 días (37 °C, 5% CO2,200 rpm).
- Mida la densidad óptica (OD) usando un espectrofotómetro para monitorear las curvas de crecimiento bacteriano hasta que la absorbancia en OD620 alcance 2.0.
- Separar los gránulos bacterianos y los medios acondicionados centrifugando a 1.000 x g durante 15 min. Lavar los gránulos bacterianos recolectados con 1x PBS y resuspend en 4 mL de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%. No incluya ningún antibiótico en el medio.
- Mantenga los gránulos bacterianos en RPMI e incube en una incubadora agitador durante 4 h a 37 °C con 5% de CO2 a una velocidad de 100 rpm.
- Para la preparación del sobrenadante probiótico, retire el gránulo bacteriano mediante centrifugación a 1000 x g,durante 15 min a 4 °C. Filtre estérilmente el sobrenadante recuperado utilizando un filtro de 0,22 μm y guárdelo a -80 °C hasta su uso.
2. Generación de esferoides
-
Preparación de líneas celulares de cáncer colorrectal
- Cultive líneas celulares DLD-1, HT-29 y WiDr como monocapas hasta una confluencia del 70-80% e incube la placa a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% (medio de crecimiento: RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina).
- Para las células cultivadas en placa de Petri de 100 mm, lave la placa dos veces con 4 ml de 1x PBS. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar la placa de Petri durante 2 min a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% para disociar las células.
- Después de la incubación, verifique la disociación celular bajo un microscopio y neutralice la tripsina-EDTA con 5 ml de medio de crecimiento.
- Transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga durante 3 min a 300 x g.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suuspend suavemente con 3 ml de medios de crecimiento.
- Cuente las células con azul de tripano para determinar las células viables utilizando un hemocitómetro. (Figura 1B (i))
-
Formación de esferoides
- En un tubo cónico de 15 ml, diluir las células de 2.1.5 para obtener 1 - 2 x 105 células/ml (Figura 1B (ii))
- Añadir la concentración final de metilcelulosa al 0,6% a la suspensión celular y transferir las células diluidas a un reservorio estéril.
NOTA: Para cada línea celular, la cantidad de metilcelulosa necesaria debe ajustarse y determinarse en consecuencia. - Utilice una pipeta multicanal para dispensar 200 μL de células a cada pozo de una microplaca inferior redonda de 96 pozos de fijación ultra baja. (Figura 1B (iii))
- Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 - 36 h.
- Después de 24 a 36 h, observe la placa bajo un microscopio de luz para garantizar la formación de esferoides.
3. Tratamiento de células de cáncer colorrectal 3D con LCFS
- Genere esferoides como se describe en los pasos 2 y 3.
- Antes de realizar el tratamiento LCFS, descongele el LCFS congelado a temperatura ambiente (RT) durante 10 - 20 min.
- Inocular la solución de acciones de LCFS en un medio de crecimiento. Diluir en serie a 25%, 12.5% y 6% en el medio de crecimiento (es decir, 25% LCFS = 150 μL de medio de crecimiento + 50 μL de LCFS).
- Saque la placa de cultivo celular que contiene esferoides de la incubadora y retire la mayor cantidad posible del medio de crecimiento de cada pozo con una pipeta de 200 μL.
- Añadir los medios de crecimiento con LCFS en las células e incubar a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 - 48 h.
NOTA: El volumen a utilizar dependerá del tamaño de la placa de la siguiente manera: 2 ml para placas de cultivo celular de 6 pozos; 200 μL para placas de cultivo celular de 96 pozos.
4. Viabilidad celular para esferoides
- Preparar de 8 a 10 esferoides de cáncer colorrectal tratados con LCFS en placas multiso de pared opaca (los ensayos de viabilidad celular se realizan 48 h después del tratamiento con LCFS).
- Descongele el reactivo de viabilidad celular (ver Tabla de Materiales)a 4 °C durante la noche.
- Equilibre el reactivo de viabilidad celular a temperatura ambiente antes de su uso.
- Antes de realizar el ensayo, retire el 50% de los medios de crecimiento de los esferoides.
- Añadir 100 μL de reactivo de viabilidad celular a cada pozo.
NOTA: El volumen a utilizar dependerá del tamaño de la placa de la siguiente manera: 100 μL para placas de cultivo celular de 96 pozos. - Mezcle el reactivo vigorosamente durante 5 minutos para promover la lisis celular.
- Incubar durante 30 min – 2 h a 37 °C.
- Registre la luminiscencia.
5. Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para esferoides
- Para cada condición, prepare de 10 a 15 esferoides en un tubo de 2 ml y centrífuga durante 3 minutos a 400 x g.
- Deseche el sobrenadante y lave los esferoides dos veces en 1 ml de 1x PBS helado.
NOTA: Evite la centrifugación, deje que los esferoides se asienten. - Aspire la mayor cantidad posible de 1x PBS y aísle el ARN utilizando un kit disponible comercialmente.
- Sintetizar ADNc a partir de 1 μg de ARN utilizando un kit disponible comercialmente según el protocolo del fabricante.
- Preparar una mezcla maestra para ejecutar todas las muestras por triplicado (consulte la Tabla 1 y la Tabla 2).
- Realice la amplificación en 20 μL de la mezcla maestra de plantilla en cada pozo de placa qPCR.
- Mezcle bien las reacciones y gire si es necesario.
- Ejecute muestras según las recomendaciones del fabricante del instrumento (Tabla 3).
6. Western blotting de esferoides
NOTA: Al recolectar esferoides, use una pipeta de 200 μL y corte el extremo de las puntas para evitar perturbar su estructura.
- Para cada condición, prepare de 30 a 40 esferoides en un tubo de 2 ml.
- Coloque el tubo sobre hielo y deje que los esferoides se asienten en la parte inferior del tubo de 2 ml.
- Deseche el sobrenadante y lave los esferoides dos veces en 1 ml de PBS helado 1x PBS
NOTA: Evite la centrifugación, deje que los esferoides se asienten. - Aspire la mayor cantidad posible de 1x PBS y agregue tampón RIPA con un cóctel inhibidor de proteasa (10 esferoides = 30 μL de tampón RIPA).
- Lise las células mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo y realice la sonicación durante 30 s con 30 s de reposo sobre hielo durante 10 ciclos.
- Centrifugar la proteína lisatos a 15000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Determinar la concentración de proteínas para cada célula lisada.
- Antes de cargar, hierva cada célula lisada en un tampón de muestra a 100 °C durante 10 min.
- Cargue cantidades iguales de proteína en los pozos del gel SDS-PAGE y ejecute el gel durante 1 a 2 h a 100 V.
- Transfiera la proteína del gel a la membrana de PVDF.
- Después de la transferencia, bloquee la membrana durante 1 h a temperatura ambiente utilizando un tampón de bloqueo (5% de leche descremada + TBS con 0.05% Tween-20).
- Incubar la membrana con diluciones 1:1.000 de anticuerpo primario(Tabla 4)en 1x TBST con tampón BSA al 5% a 4 °C durante la noche.
- Lave la membrana tres veces con TBST, 15 min por cada lavado.
- Incubar la membrana con diluciones 1:2.500 de anticuerpos secundarios en el tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 h (ver Tabla de Materiales).
- Lave la membrana tres veces con TBST, 15 min por cada lavado.
- Prepare la membrana para la detección de HRP con un sustrato quimioluminiscente.
- Adquirir imágenes quimioluminiscentes.
7. Tinción de yoduro de propidio (PI) de esferoides
- Prepare 5-10 esferoides como se describe en el Paso 4.1 y coloque los esferoides en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2.
- Diluya un stock de 1 mg/ml de PI 1:100 en 1x PBS.
- Retire el 50% del medio de cada pozo de la placa de 96 pozos.
- Agregue 100 μL de la solución PI a cada pozo y coloque los pozos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 durante 10 - 15 min.
- Lave la solución PI con 1x PBS.
- Agregue 200 μL de medio de crecimiento y tome una imagen con un microscopio de fluorescencia. Analice la intensidad de la fluorescencia utilizando la Imagen J para obtener el recuento de viabilidad del esferoide.
8. Análisis FACS de esferoides
- Generar esferoides como se describió anteriormente.
- Para cada condición, prepare de 30 a 40 esferoides en un tubo FACS y centrífuga durante 3 minutos a 400 x g y RT.
- Aspire el sobrenadante y lave los esferoides en 3 ml de 1x PBS, luego centrífuga a 400 x g durante 3 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante y agregue 200 μL de tripsina-EDTA al 0,25%, luego incube en RT durante 2 -3 min.
NOTA: El tiempo de incubación depende del tamaño del esferoide y del tipo de célula. - Agregue 1 ml de tampón FACS y disocia suavemente los esferoides con una pipeta de 200 μL.
- Centrifugar las células disociadas a 400 x g y 4 °C durante 3 min.
NOTA: Búfer FACS = 1x PBS + 2.5% FBS, filtrado usando un filtro superior de 0.22 μm. - Deseche el sobrenadante y añada el reactivo 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/muestra).
- Vórtice suavemente las células e incube durante 13 a 30 minutos en RT en la oscuridad.
- Agregue 500 μL de tampón FACS y filtre las células utilizando tubos de ensayo de poliestireno cónico para eliminar las células agregadas.
- Centrifugadora a 400 x g y 4 °C durante 3 min.
- Añadir 500 μL de tampón de unión a la anexina V a cada tubo y resuspend.
- Analice utilizando un citómetro de flujo.
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Representative Results
Describimos el protocolo de obtención de esferoides a partir de diversas líneas celulares de cáncer colorrectal. Se requirió suplementación con metilcelulosa para generar esferoides. También presentamos un método de preparación de LCFS y presentamos un modelo para estudiar la correlación entre los probióticos y el cáncer colorrectal. Los protocolos de formación de esferoides y preparación de LCFS se ilustran esquemáticamente en la Figura 1A,B. Como se muestra en la Figura 2A,la concentración de metilcelulosa del 0,6% transforma las células cancerosas en esferoides compactos. Este resultado indica que los esferoides se pueden generar a partir de varios tipos de cáncer colorrectal mediante el uso de nuestro protocolo de metilcelulosa. A continuación, los esferoides fueron tratados con un 25% de LCFS y se estudió la morfología después de 48 h utilizando un microscopio de luz. Como se muestra en la Figura 3A,los esferoides de los grupos tratados con LCFS exhibieron superficies interrumpidas. Para investigar los efectos anticancerígenos de LCFS a concentraciones adecuadas, los esferoides se trataron durante 48 h con varias dosis de LCFS: 0 (control), 6%, 12.5% y 25%. Se observaron alteraciones en la morfología de los esferoides en los esferoides tratados con 25% de LCFS, como se muestra en la Figura 3B. Además, los esferoides fueron tratados con 25% de LCFS durante 24 h y 48 h, y se observaron alteraciones en la morfología de los esferoides después de 48 h de tratamiento. Las imágenes microscópicas de los esferoides se muestran en la Figura 3C.
Después de 48 h, las muestras se evaluaron con ensayo de viabilidad celular, y se observó muerte celular por cáncer colorrectal al tratamiento con LCFS de manera dependiente de la dosis, mayor la cantidad de LCFS mayor la muerte celular observada (Figura 3D). Nosotros, entonces, tiñimos las muestras con yoduro de propidio (PI) para observar la apoptosis. Como era de esperar, la inducción de la apoptosis fue dependiente de la dosis de LCFS(Figura 4A,B,C). Se realizó RT-PCR para detectar los cambios en los marcadores moleculares de apoptosis, es decir, BAX, BAK y NOXA(Figura 5A,B). Por último, se estudiaron los marcadores de apoptosis utilizando western blotting y Annexin V/7AAD a través de FACS(Figura 6A,B,C,D). Estas observaciones muestran que LCFS indujo efectivamente la apoptosis en el modelo 3D.
Figura 1: Representación esquemática de la formación de esferoides y preparación de LCFS.
(A) Las imágenes de representación esquemática del protocolo de generación de LCFS están marcadas por (i-iv) (B) Los esquemas de la formación de esferoides mediados por metilcelulosa están marcados por (i-iii). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Formación de esferoides mediada por metilcelulosa.
(A) Imágenes representativas de la formación de esferoides mediada por metilcelulosa de HT-29, DLD1 y WiDr. Las células se sembraron en placas inferiores redondas de 96 pozos de fijación ultra baja con concentraciones de metilcelulosa de 0.1-1.2% durante 48 h. Barra de escala 10 μm (n=3 para cada experimento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de la concentración de LCFS y la morfología de los esferoides.
(A) Imágenes representativas de HT-29 tratadas con LCFS durante 48 h. Barra de escala 100 μm. (B) Esferoides HT-29, DLD1 y WiDr tratados con dosis crecientes de LCFS durante 48 h. Todos los esferoides habían interrumpido los bordes en 12.5-25% LCFS. Barra de escala 20 μm (n=3 para cada experimento) (C) Morfologías esferoides de esferoides HT-29, DLD1 y WiDr tratados con LCFS al 25% durante 24 y 48 h. Barra de escala 20 μm (n = 3) (D) Viabilidad celular medida, mostrada como media ± SEM. ***, P < 0,05 (n = 3 para cada experimento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción de yoduro de propidio de los esferoides.
Imágenes representativas de tinción pi en (A) HT-29, (B) DLD1 y (C) esferoides WiDr después de 48 h de tratamiento con LCFS. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia y el aumento de la intensidad de PI se midió utilizando la imagen J. Barra de escala de 10 μm. Se muestra la media ± SEM. , P < 0,05 (n = 3 para cada experimento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Los marcadores de apoptosis se identificaron mediante qRT-PCR.
Se cuantificaron los marcadores de apoptosis, como BAX, BAK y NOXA. La cuantificación del ARNm se presenta como una expresión relativa normalizada a (A) β-actina y (B) 18s rRNA. Se muestra la media ± SEM. , P < 0,05 (n=3 para cada experimento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Los marcadores de apoptosis se determinaron mediante Western blotting y análisis FACS de los esferoides.
En la figura se muestran manchas occidentales de (A) HT-29, (B) DLD1 y (C) células WiDr después del tratamiento con LCFS. Se detectaron PARP1, BCL-XL y p-IκBα. β-actina se utilizó como control interno. (D) Análisis FACS de la apoptosis en esferoides HT-29, DLD1 y WiDr incubados con LCFS. Las células apoptóticas se detectaron por el aumento de la intensidad de fluorescencia de la anexina V-FITC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reacción | Volumen por sencillo 20 μL |
| Mezcla 2X qPCR | 10 μL |
| Imprimación delantera (10 pmols/μL) | 1 μL |
| Imprimación inversa (10 pmols/μL) | 1 μL |
| aDNc (50 ng/μL) | 1 μL |
| Agua de grado PCR | 7 μL |
Tabla 1: Mezcla de reacción de PCR.
| Cebador | Secuencia |
| BAX-Forward | CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG |
| BAX-Reverso | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK-Adelante | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK-Reverso | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA-Forward | ACCAAGCCGGATTTGCGATT |
| NOXA-Reverso | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18s rRNA-Forward | GATGGGCGGCGGAAAATAG |
| 18s rRNA-Reverso | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-Actin-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-Actina-Inversa | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
Tabla 2: Secuencias de imprimación utilizadas en el análisis qRT-PCR.
| Etapa | Temperatura (ºC) | Hora |
| Desnaturalización inicial | 95 | 10 minutos |
| 40 ciclos: | ||
| Paso 1 | 95 | 15 segundos |
| Paso 2 | 60 | 60 segundos |
| Etapa de curva de fusión | 95 | 15 segundos |
| 60 | 60 segundos | |
| 95 | 15 segundos | |
Tabla 3: Condiciones de qRT-PCR.
| Anticuerpo | Dilución |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-actina (C4) | 1:1000 |
| Cabra Anti-Ratón IgG (H+L) | 1:2500 |
| Cabra Anti-Conejo IgG (H+L) | 1:2500 |
Tabla 4: Anticuerpos utilizados en el análisis de western blot.
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Discussion
El microambiente tisular, incluyendo las células vecinas y la matriz extracelular (ECM), es fundamental para la generación de tejidos y crucial en el control del crecimiento celular y el desarrollo tisular13. Sin embargo, los cultivos 2D tienen varias desventajas, como la interrupción de las interacciones celulares, así como alteraciones en la morfología celular, los ambientes extracelulares y el enfoque de la división14. Los sistemas de cultivo celular 3D han sido rigurosamente estudiados para reproducir mejor los efectos in vivo, y han sido probados como sistemas más precisos para las pruebas de cáncer in vitro15,16. Existe la necesidad de sistemas modelo para predecir con mayor precisión las respuestas personalizadas a la quimioterapéutica17.
El andamiaje 3D fue desarrollado para la ingeniería de tejidos. Actúa como una pérdida sustituta de ECM, representando el espacio disponible de las células tumorales. Además, el andamiaje proporciona interacciones físicas para la adhesión y proliferación celular y hace que las células formen distribuciones espaciales apropiadas e interacciones célula-ECM o célula-célula18. El polímero de metilcelulosa (MC) ha sido estudiado continuamente para determinar su idoneidad en la generación de sistemas de hidrogel basados en MC para aplicaciones en ingeniería de cultivo celular 3D19,20. Sin embargo, la incorporación intacta de estos hidrogeles en biomateriales como las redes celulares 3D sigue siendo técnicamente desafiante21. Por lo tanto, el protocolo de formación de esferoides presentado aquí recomienda la titulación de las concentraciones de MC y la optimización con varios puntos de tiempo para cada línea celular CRC. Las características específicas de la línea celular, como la agregación celular, la viabilidad y la muerte, pueden afectar significativamente cada una de las condiciones que probamos. Este método puede proporcionar un medio para generar esferoides uniformes para probar LCFS en células cancerosas.
Los probióticos, que son bacterias beneficiosas, producen metabolitos activos que potencialmente pueden imitar los efectos anticancerígenos. Por lo tanto, nuestro estudio fue diseñado para aislar las bacterias del ácido láctico (LAB) y probar los efectos anticancerígenos de sus extractos metabólicos de sobrenadantes libres de células (SFC). Nuestros estudios proporcionaron un método para observar los efectos de los sobrenadantes libres de células de L. fermentum que induce la muerte celular apoptótica en células de cáncer colorrectal en un sistema 3D. Los niveles de ARNm de los marcadores de apoptosis involucrados en las vías apoptóticas se inducen dramáticamente después de la exposición a LCFS en condiciones 3D. Además, se expresaron niveles disminuidos de PARP1 y BCL-XL en el control de esferoides 3D tratado con LCFS en comparación con el control de la Figura 4C, D,E. También se observó inhibición de la activación de NF-κB en cultivos 3D después del tratamiento con LCFS. En conjunto, las ventajas de cultivar células en 3D incluyen el aumento de las interacciones célula-célula y las respuestas a las moléculas de señalización para imitar mejor los sistemas in vivo. Western blotting usando esferoides puede conducir a información cuantitativa sobre el estado de varias moléculas de señalización.
Las líneas celulares tienen ciertas limitaciones como modelos preclínicos de investigación del cáncer. Recientemente, los organoides cancerosos se han utilizado en el modelado de la terapia personalizada contra el cáncer22,23. Se espera que el tratamiento de LCFS con probióticos en organoides se utilice como una plataforma poderosa para probar los efectos anticancerígenos. Además, solo probamos una de las especies de Lactobacillus entre los diversos probióticos en el modelo de cáncer. Varios probióticos también están siendo probados para la prevención del síndrome metabólico, inmunológico y trastornos neurológicos24,25,26. LCFS de las especies Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcusy Akkermansia son candidatos potenciales para la prueba de beneficios para la salud a través de varios tipos de modelos de enfermedades27,28,29.
Sobre la base de este estudio, se puede concluir que la comprensión de la señalización en esferoides y las diversas respuestas al tratamiento con LCFS en modelos 3D puede ser beneficiosa para probar los efectos anticancerígenos utilizando el método que propusimos. Además, los modelos de cáncer 3D pueden proporcionar varias ventajas que no son posibles con las monocapas 2D tradicionales.
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Disclosures
Los autores no tienen divulgaciones financieras relevantes.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por los programas "Establecimiento de estándares de medición para química y radiación", número de subvención KRISS-2020-GP2020-0003, y "Desarrollo de estándares de medición y tecnología para biomateriales y convergencia médica", número de subvención KRISS-2020-GP2020-0004, financiado por el Instituto de Investigación de Estándares y Ciencia de Corea. Esta investigación también fue apoyada por el Ministerio de Ciencia y TIC (MSIT), la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2019M3A9F3065868), el Ministerio de Salud y Bienestar (MOHW), el Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI, HI20C0558), el Ministerio de Comercio, Industria y Energía (MOTIE) y el Instituto de Evaluación de Tecnología Industrial de Corea (KEIT, 20009350). ID de ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Agradecemos a Chang Woo Park por su ayuda con los experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
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