使用延时显微镜连续测量 大肠杆菌 中的生物噪声
Summary
这项工作提出了一种显微镜方法，允许对 大肠杆菌 的单个细胞进行活成像，以便分析和量化合成基因电路的随机行为。
Abstract
这里开发的协议提供了一个工具，使计算机跟踪 大肠杆菌 分裂和荧光水平在几个小时内。这个过程开始于筛选在最少的媒体上生存的殖民地，假设只有窝藏正确质粒的 大肠杆菌 才能在特定条件下茁壮成长。由于构建大型基因电路（需要组装许多DNA部分）的过程具有挑战性，因此电路组件通常以不同的拷贝数分布在多个质粒之间，需要使用多种抗生素。质粒中的突变会破坏抗生素耐药基因的转录，并与细胞中的资源管理相交，导致坏死。选定的殖民地设置在玻璃底培养皿上，并选择几个焦点平面在明亮的领域和荧光域进行显微镜跟踪。该协议在无法监管的初始条件下将图像焦点保持在 12 小时以上，造成一些困难。例如，经过几个小时的成像后，死细胞开始积聚在透镜的聚焦领域，这会导致毒素积聚，信号变得模糊和衰变。营养物质的消耗引入了新的代谢过程，阻碍了电路的预期反应。实验的温度降低了诱导剂和抗生素的疗效，这会进一步损害信号的可靠性。最小的介质凝胶收缩和干燥，因此光学对焦会随着时间而改变。我们开发了这种方法来克服 大肠杆菌的这些挑战，类似于以前为其他微生物开发类似方法的工作。此外，该方法还提供了一种算法来量化未改变和改变的细胞中的总随机噪声，发现结果与类似变异系数 （CV） 所示的流量分析仪预测一致。
Introduction
合成生物学是近十年来出现的一个多学科领域，旨在将工程设计原理转化为合理的生物设计1、2、3，努力实现活细胞的多信号集成和处理，以理解基础科学4、5、诊断、治疗和生物技术应用6、7、8、9、10。我们量化合成基因电路输入输出响应的能力已经随着单细胞技术的最新进展而发生了革命性进展，包括使用自动延时显微镜11的流动分析仪和活细胞成像。流分析仪常用于测量这些电路在稳定状态1、12的反应，倒显微镜用于测量合成基因回路在单细胞3水平上的动态反应。例如，合成生物学的早期工作之一涉及利用负反馈回路在活细胞中建立遗传振荡器网络，延迟3。后来，基因振荡器回路被应用于了解活细胞4的动态环境中的代谢控制。自动延时显微镜是描述此类电路的一种方法。我们假设宿主细胞，大肠杆菌，在形成微殖民地时同步，允许测量信号和计算噪音，而无需跟踪确切的母女关系。
噪音是生物系统的基本固有方面，通常由多种来源产生。例如，生化反应涉及来自分离随机载体的传输的信号，如蛋白质的扩散13。这些信号以随机波动14传播。其他噪声源包括资源可用性、细胞分裂和环境条件的变化，如温度、湿度和压力。在合成基因电路中传播的生物信号通常具有非常低的信号与噪声比（SNR），这扰乱了这些电路的性能。因此，基因电路设计仍然是基因工程15最具挑战性的方面之一。例如，与大多数只计算平均基因表达的方法（测量整个细胞群）相比，考虑测量信号的方差，以便通过合成基因网络12来设计可预测的行为。因此，蛋白质表达中的变异性或噪声水平在模拟和数字基因电路1、16、17的设计和性能中起着主导作用。
已经开发出许多方法来量化细胞对细胞的变异性，包括在大肠杆菌3，7，18。这些方法通常用于研究基因活化和代谢通路，但较少侧重于随机噪声动力学的研究，如测量和分离特定的噪声源，特别是活细胞中的遗传回路，这是一个根本的挑战19，20，21。几个因素，既继承到电路本身（内在的），又从宿主细胞（外在）中衍生出来，可以扰乱遗传电路的连续性能。在本文中，我们制定了一个协议，旨在量化大肠杆菌细胞的总噪声，包括内在和外在噪声源6，22。通过量化总噪声，然后评估SNR23，基因电路的设计可以改进。通过监测几种荧光蛋白6、20，可以修改这种方法，分别测量独立的噪声源。对于此处描述的协议，我们保持良好的环境条件控制，并不断测量细胞的活性，而不受外部因素的影响。随着时间的推移，我们测量单个细胞中荧光蛋白发出的信号，并同时在蔗糖基板下对它们进行成像。使用实验室的自定义 MATLAB 分析生成的图像。
理想情况下，连续测量细胞内荧光蛋白的实时活性将通过细胞的生长和分裂产生准确的数据。然而，获取此类数据是具有挑战性的。这是由于荧光蛋白的退化，称为光漂白7，当他们暴露在辐射的兴奋过程中。此外， 大肠杆菌 细胞对兴奋也很敏感，这可能导致光毒性7。这两个问题都限制了可获取的相框数量和收购之间的时间。用于在成像过程中生长细胞的基质和中等类型（如溶酶肉汤）也具有关键作用。我们强烈建议使用最小的介质，最大限度地减少非荧光背景，延长细胞分裂时间。
此外，需要根据以下要求（1） 低细胞分裂率来准备样本，以便减少频繁的暴露，从而密切成像分裂周期并降低光毒性和光漂白的概率。我们在实验开始时将采集时间设定为预测的线粒体时间 （2） 低细胞密度的一半左右，从而能够提高分裂的均匀性和可跟踪性。细胞密度受 大肠杆菌 细胞稀释比的影响，大肠杆菌是该协议成功的一个重要参数，需要为每个实验室确定。为了确定这一比率，使用的每一个新的 大肠杆菌 菌株或介质应安装增长率图（补充图1）。如果细胞在初始密度约为600nm = 0.1 的短暂孵化后无需额外摇晃即可生长，则已实现适当的比率。处于这一阶段的细胞将仅根据环境温度（3） 限制细胞运动而分裂：细胞运动在很大程度上取决于基板（糖垫）的牢固性。基板的硬度取决于总糖量和凝胶凝固时间。凝胶不能在室温下过夜凝固，因为 大肠杆菌 将经历线粒体。影响基板稳定性的其他因素包括样品中的水量和湿度。代表结果中详细讨论了其他问题。此协议提供了许多详细信息，并逐渐从一个步骤移动到另一个步骤。该协议为成像实验提供了长期稳定性，并提供了一个基本的图像处理工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项工作中，我们开发了一个协议，使计算机跟踪 大肠杆菌 活细胞，在几个小时内跟随分裂和荧光水平。该协议使我们能够通过实时测量简历和SNR来量化 大肠杆菌 遗传电路的随机动力学。在此协议中，我们比较了 图 10中显示的两个不同电路的随机行为。研究表明，拷贝数低的质粒更容易产生痉挛效应，受细胞分裂的影响较小。第一个电路构成表示GFP（图10a）?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢吉尔·盖尔伯特先生（电气工程学院，技术学院）协助MATLAB代码。我们感谢李锡铭博士（生物医学工程学院，技术）协助校对本文。这项研究得到了Neubauer家庭基金会和以色列科学部的部分支持，授予2027345。
Materials
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD – Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD – Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD – Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
Referências
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