タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定
Summary
この研究は、合成遺伝子回路の確率的挙動の分析と定量化のために 、大腸菌 の単一細胞の生画像化を可能にする顕微鏡法を提示する。
Abstract
ここで開発されたプロトコルは、数時間にわたって 大腸菌 部門と蛍光レベルのコンピュータ追跡を可能にするツールを提供しています。このプロセスは、正しいプラスミドを抱える 大腸菌 だけが特定の条件で繁栄することができると仮定して、最小限の媒体で生き残るコロニーのスクリーニングから始まります。多くのDNA部品の組み立てを必要とする大規模な遺伝子回路を構築するプロセスは困難であるため、回路部品は、多くの場合、いくつかの抗生物質の使用を必要とする異なるコピー番号で複数のプラスミド間で分布しています。プラスミドの突然変異は、抗生物質耐性遺伝子の転写を破壊し、壊死につながる細胞内の資源管理と介入する可能性がある。選択されたコロニーはガラス底のペトリ皿にセットされ、明るい分野および蛍光領域の両方の顕微鏡追跡のためにいくつかの焦点面が選ばれる。このプロトコルは、規制できない初期条件下で 12 時間以上画像のフォーカスを維持し、いくつかの困難を生み出します。例えば、死んだ細胞は、数時間のイメージングの後にレンズの焦点分野に蓄積し始め、毒素が蓄積し、信号がぼやけて減衰する原因となります。栄養素の枯渇は、新しい代謝プロセスを導入し、回路の所望の応答を妨げます。実験の温度は、誘導剤および抗生物質の有効性を低下させ、信号の信頼性をさらに損なう可能性がある。最小のメディアゲルが収縮し、乾燥し、その結果、光学的焦点は時間の経過とともに変化します。我々は、他の微生物に対する類似法を開発した以前の作品と同様に、 大腸菌でこれらの課題を克服するためにこの方法を開発しました。さらに、この方法は、変化しない細胞および変化した細胞の総確率的ノイズを定量化するアルゴリズムを提供し、同様の変動係数(CV)で示されるように、結果がフローアナライザ予測と一致していることを発見する。
Introduction
合成生物学は、過去10年間に出現した学際的な分野であり、工学設計原理を合理的な生物学的設計1、2、3に変換し、基本科学4、5、診断、治療およびバイオテクノロジーアプリケーション6、7、8、9、10を理解するために、生体細胞における多信号統合と処理を達成することを目指しています。合成遺伝子回路の入力出力応答を定量化する当社の能力は、自動タイムラプス顕微鏡11を用いたフローアナライザやライブセルイメージングを含む単細胞技術の最近の進歩によって革命化されている。フローアナライザは、定常状態1、12においてこれらの回路の応答を測定するためによく使用され、反転顕微鏡は、単一細胞3のレベルでの合成遺伝子回路の動的応答を測定するために使用される。例えば、合成生物学の初期の研究の1つは、遅延3を伴う負のフィードバックループを使用して生きている細胞における遺伝的発振器ネットワークの構築を含んでいた。その後、生細胞4の動的環境における代謝制御を理解するために、遺伝的発振回路を適用した。自動時間経過顕微鏡は、このような回路を特徴付ける方法の1つです。我々は、宿主細胞である大腸菌がマイクロコロニーを形成する際に同期し、正確な母娘関係を追跡することなく、信号の測定とノイズの計算を可能にすることを仮説とする。
ノイズは、多くの場合、複数のソースから生じる生物学的システムの基本的な、固有の側面です。例えば、タンパク質13の拡散のような離散的なランダムキャリアの輸送に由来するシグナルを含む生化学的反応を考えてみましょう。これらの信号はランダムな変動14で伝播する。その他のノイズ源としては、資源の利用可能性、細胞分裂、温度、湿度、圧力などの環境条件の変動があります。合成遺伝子回路で伝播する生体信号は、多くの場合、このような回路の性能を乱す非常に低い信号対雑音比(SNR)を有する。したがって、遺伝子回路設計は、遺伝子工学15の最も困難な側面の1つです。例えば、平均遺伝子発現のみを計算する(細胞全体の母集団にわたって測定される)ほとんどのアプローチとは対照的に、測定されたシグナルの分散は、合成遺伝子ネットワーク12を介して予測可能な行動を設計するために考慮される。したがって、タンパク質発現における変動性またはノイズのレベルは、アナログおよびデジタル遺伝子回路1、16、17の設計と性能において支配的な役割を果たす。
大腸菌3、7、18を含む細胞間変動を定量化するために多くのアプローチが開発されている。これらの方法は、遺伝子の活性化と代謝経路を研究するためによく使用されるが、特にこれが基本的な課題である生細胞における遺伝的回路に対して、特定のノイズ源の測定や分断のような確率的ノイズダイナミクスの研究にあまり焦点を当てずに使用される。いくつかの要因は、回路自体に継承され(組み込み)、宿主細胞(外因)から派生し、遺伝的回路の連続的な性能を乱す可能性があります。本論文では、固有および外因性ノイズ源6,22を含む大腸菌細胞の全雑音を定量化することを目的としたプロトコルを開発した。全ノイズを定量化し、SNR23を評価することで、遺伝子回路の設計を改善することができます。この方法は、いくつかの蛍光タンパク質6,20を監視することにより、独立したノイズ源を別々に測定するように改変することができる。ここで説明するプロトコルについては、環境条件を十分に制御し、外部要因の影響を受けることなく細胞の活性を継続的に測定します。一つの細胞内の蛍光タンパク質からのシグナルを時間の経過とともに測定し、同時にアガロース基板の下で画像化します。結果の画像は実験室のカスタムMATLABを使用して分析される。
理想的には、細胞内の蛍光タンパク質のリアルタイム活性を連続的に測定すると、細胞の増殖と分裂を通じて正確なデータが生成されます。しかし、そのようなデータを取得することは困難です。これは、励起プロセスで放射線にさらされたときの蛍光タンパク質(光漂白7)の分解によるものです。さらに、 大腸菌 細胞も興奮に敏感であり、光毒性7を引き起こしうる。どちらの問題でも、取得できるフォトフレームの量と取得までの時間が制限されます。イメージング中に細胞を増殖させるために使用される基質および培地タイプ(例えば、リソゲニーブロス)も重要な役割を有する。蛍光性を最小限に抑え、細胞分裂時間を延長する最小限の培地を使用することを強くお勧めします。
さらに、サンプルは、以下の要件を考慮して調製する必要があります(1)低細胞分割率は、分割サイクルを密接にイメージングし、光毒性および光漂白の確率を低減するためのより少ない頻度の露出を可能にします。(2)実験の初めに、取得時間を約半分のマイルス化時間(2)低い細胞密度に設定することで、分裂の均一性と追跡性を向上させます。細胞密度は、このプロトコルの成功のための重要なパラメータであり、すべてのラボのために決定する必要がある 大腸菌 細胞の希釈比の影響を受けます。比率を確立するために、新しい 大腸菌 株または使用される媒体のそれぞれは、成長率グラフを取り付ける必要があります(補足図1)。OD600nm = 0.1程度の初期密度から短いインキュベーション後に細胞が追加の揺れなしで成長できる場合、適切な比率が達成されました。この段階での細胞は、環境温度のみに応じて分裂する(3)細胞の動きの制限:細胞の動きは基質(アガロースパッド)の硬さに強く依存する。基材のハリは、総アガロースの量とゲル凝固時間に依存します。 エシェリヒア大腸菌 は有糸分裂を起じるように、ゲルを室温で一晩固化させることはできません。基板の安定性に影響を与える他の要因は、サンプルおよび湿度中の水の量を含む。その他の問題については、「代表結果」で詳しく説明します。このプロトコルは、多くの詳細を提供し、徐々に別のステップから移動します。このプロトコルは、イメージング実験に長い安定性を提供し、基本的な画像処理ツールを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、エ シェリヒア・コリ 生細胞のコンピュータトレースを可能にするプロトコルを開発し、時間の経過に従って分裂および蛍光レベルを追った。このプロトコルは、我々はリアルタイムでCVとSNRを測定することにより 、大腸菌 の遺伝的回路の確率的ダイナミクスを定量化することができます。このプロトコルでは、 図 10に示すように、2 つの異なる回路?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MATLABコードを支援してくれたギル・ゲルバート氏(電気工学部、テクニオン)に感謝します。この記事の校正を支援してくれたXiming Li博士(バイオメディカル工学部、テクニオン)に感謝します。この研究は、ノイバウアー家財団とイスラエル科学省が2027345を助成金として支えたものです。
Materials
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD – Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD – Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD – Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
Referências
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. . Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. . Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. . Noise in Measurements. , (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. . SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells – Stylianidou – 2016 – Molecular Microbiology. , (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society – Biology Science. 207, 187-217 (1980).
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. . Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
