يقدم هذا العمل طريقة المجهر التي تسمح بالتصوير الحي لخلية واحدة من الإشريكية القولونية لتحليل وتكميم السلوك العشوائي للدوائر الجينية الاصطناعية.
يقدم البروتوكول الذي تم تطويره هنا أداة لتمكين تتبع الكمبيوتر لقسم الإشريكية القولونية ومستويات الفلورسنت على مدى عدة ساعات. تبدأ العملية بالفحص بحثا عن المستعمرات التي تعيش على الحد الأدنى من الوسائط ، على افتراض أن الإشريكية القولونية التي تؤوي البلازميد الصحيح هي وحدها القادرة على الازدهار في الظروف المحددة. وبما أن عملية بناء دوائر جينية كبيرة، تتطلب تجميع العديد من أجزاء الحمض النووي، فإن مكونات الدائرة غالبا ما توزع بين البلازميدات المتعددة بأعداد نسخ مختلفة تتطلب استخدام العديد من المضادات الحيوية. الطفرات في البلازميد يمكن أن تدمر نسخ جينات مقاومة المضادات الحيوية وتتداخل مع إدارة الموارد في الخلية مما يؤدي إلى نخر. يتم تعيين مستعمرة مختارة على طبق بيتري الزجاج القاع ويتم اختيار عدد قليل من الطائرات التركيز لتتبع المجهر في كل من المجال مشرق والمجالات الفلورية. يحافظ البروتوكول على تركيز الصورة لأكثر من 12 ساعة في ظل ظروف أولية لا يمكن تنظيمها ، مما يخلق بعض الصعوبات. على سبيل المثال، تبدأ الخلايا الميتة في التراكم في مجال تركيز العدسات بعد بضع ساعات من التصوير، مما يؤدي إلى تراكم السموم وطمس الإشارة وتسوسها. استنفاد المواد الغذائية يدخل عمليات التمثيل الغذائي الجديدة وتعيق الاستجابة المرجوة من الدائرة. درجة حرارة التجربة يقلل من تأثير الحث والمضادات الحيوية، والتي يمكن أن تلحق المزيد من الضرر موثوقية الإشارة. يتقلص الحد الأدنى من هلام الوسائط ويجفف ، ونتيجة لذلك يتغير التركيز البصري بمرور الوقت. طورنا هذه الطريقة للتغلب على هذه التحديات في الإشريكية القولونية، على غرار الأعمال السابقة التي تطور أساليب مماثلة للكائنات الدقيقة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الطريقة خوارزمية لتحديد إجمالي الضوضاء العشوائية في الخلايا غير المعدلة والمتغيرة ، حيث وجدت أن النتائج تتسق مع توقعات محلل التدفق كما هو موضح في معامل مماثل للاختلاف (CV).
علم الأحياء التركيبي هو مجال متعدد التخصصات ظهر في العقد الماضي ويهدف إلى ترجمة مبادئ التصميم الهندسي إلى تصميم بيولوجي عقلاني1،2،3 ،فيمحاولةلتحقيق التكامل والمعالجة متعددة الإشارات في الخلايا الحية لفهم العلوم الأساسية4و5والتطبيقات التشخيصية والعلاجية والتكنولوجيا الحيوية6و7و8و9و10. لقد أحدثت قدرتنا على قياس استجابة المدخلات والمخرجات من دوائر الجينات الاصطناعية ثورة بسبب التقدم الأخير في تكنولوجيا الخلية الواحدة ، بما في ذلك محلل التدفق وتصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر الآلي الفاصل الزمني11. غالبا ما يستخدم محلل التدفق لقياس استجابة هذه الدوائر في الحالة الثابتة1،12، ويستخدم المجهر المقلوب لقياس الاستجابة الديناميكية للدوائر الجينية الاصطناعية على مستوى خلية واحدة3. على سبيل المثال، واحدة من الأعمال المبكرة في البيولوجيا الاصطناعية تنطوي على بناء شبكات المذبذب الجيني في الخلايا الحية باستخدام حلقات التغذية المرتدة السلبية مع تأخير3. في وقت لاحق ، تم تطبيق دوائر المذبذب الجيني لفهم التحكم الأيضي في البيئة الديناميكية للخلايا الحية4. المجهر الآلي الفاصل الزمني هو أحد الطرق لتوصيف مثل هذه الدوائر. نحن نفترض أن الخلايا المضيفة، الإشريكية القولونية،مزامنة عند تشكيل المستعمرات الصغيرة، مما يسمح لقياس إشارة وحساب الضوضاء دون تتبع العلاقات الدقيقة الأم وابنتها.
الضوضاء هي أحد الجوانب الأساسية المتأصلة في النظم البيولوجية التي تنشأ في كثير من الأحيان من مصادر متعددة. النظر على سبيل المثال، التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تنطوي على الإشارات التي تنشأ من نقل ناقلات عشوائية منفصلة مثل نشر البروتينات13. هذه الإشارات تنتشر مع تقلبات عشوائية14. مصادر الضوضاء الأخرى هي توافر الموارد، وتقسيم الخلايا والاختلافات في الظروف البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة والضغط. غالبا ما يكون للإشارات البيولوجية التي تنتشر في دوائر الجينات الاصطناعية نسبة إشارة منخفضة جدا إلى الضوضاء (SNR) ، مما يزعج أداء هذه الدوائر. لذلك ، لا يزال تصميم الدائرة الوراثية أحد الجوانب الأكثر تحديا في الهندسة الوراثية15. على سبيل المثال ، على النقيض من معظم النهج التي تحسب فقط متوسط التعبير الجيني (تقاس على مجموع سكان الخلية) ، ويعتبر الفرق في إشارة قياس من أجل هندسة السلوك يمكن التنبؤ بها من خلال شبكات الجينات الاصطناعية12. على هذا النحو ، فإن مستويات التباين أو الضوضاء في التعبير البروتين تلعب دورا مهيمنا في تصميم وأداء الدوائر الجينية التناظرية والرقمية1،16،17.
وقد تم تطوير العديد من النهج لتحديد التباين من خلية إلى خلية، بما في ذلك في الإشريكية القولونية 3،7،18. وغالبا ما تستخدم هذه الأساليب لدراسة تنشيط الجينات ومسارات التمثيل الغذائي، ولكن مع تركيز أقل على دراسة ديناميات الضوضاء العشوائية، مثل قياس وتفكيك مصادر ضوضاء محددة، وخاصة بالنسبة للدوائر الوراثية في الخلايا الحية حيث هذا هو التحدي الأساسي19،20،21. عدة عوامل، سواء الموروثة إلى الدائرة نفسها (الجوهرية) والمستمدة من الخلايا المضيفة (extrinsic)، يمكن أن تعكر صفو الأداء المستمر للدوائر الوراثية. في هذه الورقة ، وضعنا بروتوكولا يهدف إلى تحديد إجمالي الضوضاء في خلايا الإشريكية القولونية ، بما في ذلك مصادر الضوضاء الجوهرية والقشرية6و22. من خلال تحديد إجمالي الضوضاء ومن ثم تقييم SNR23، يمكن تحسين تصميم دوائر الجينات. يمكن تعديل هذه الطريقة لقياس مصادر الضوضاء المستقلة بشكل منفصل ، من خلال مراقبة العديد من البروتينات الفلورية6،20. بالنسبة للبروتوكول الموصوف هنا ، نحافظ على الظروف البيئية تحت رقابة جيدة ونقيس باستمرار نشاط الخلايا دون تأثير العوامل الخارجية. نقيس الإشارة من البروتينات الفلورية في خلايا واحدة مع مرور الوقت ونصورها في وقت واحد تحت ركيزة الآغاروز. يتم تحليل الصور الناتجة باستخدام MATLAB المخصصة للمختبر.
من الناحية المثالية ، فإن القياس المستمر للنشاط في الوقت الحقيقي للبروتينات الفلورية داخل الخلية سينتج بيانات دقيقة من خلال نمو الخلايا وتقسيمها. ومع ذلك، فإنه من الصعب الحصول على هذه البيانات. ويرجع ذلك إلى تدهور البروتينات الفلورية ، والمعروفة باسم تبييض الصور7، عندما يتعرضون للإشعاع في عملية الإثارة. وعلاوة على ذلك، خلايا الإشريكية القولونية هي أيضا حساسة للإثارة، والتي قد تؤدي إلى السمية الضوئية7. وتحد المسألتان من كمية إطارات الصور التي يمكن الحصول عليها والوقت بين عمليات الاستحواذ. الركيزة والأنواع المتوسطة (مثل مرق الليوجيني) التي تستخدم لزراعة الخلايا أثناء التصوير لها أيضا دور حاسم. نوصي بشدة باستخدام الحد الأدنى من الوسط ، مما يقلل من الخلفية غير الفلورية ويطيل وقت تقسيم الخلية.
وعلاوة على ذلك، يجب إعداد العينة بالنظر إلى المتطلبات التالية (1) يسمح انخفاض معدل انقسام الخلايا بالتعرض بشكل أقل تواترا للتصوير عن كثب لدورة التقسيم وتقليل احتمال السمية الضوئية والbleaching. وضعنا وقت الاستحواذ على حوالي نصف وقت الانقسام المتوقع (2) كثافة الخلايا المنخفضة في بداية التجربة تسمح بتوحيد أفضل وتتبع الانقسام. تتأثر كثافة الخلايا بنسبة تخفيف خلايا الإشريكية القولونية، وهي معلمة مهمة لنجاح هذا البروتوكول وتحتاج إلى تحديد لكل مختبر. من أجل تحديد النسبة، ينبغي أن تكون مزودة كل سلالة جديدة من الإشريكية القولونية أو وسائل الإعلام المستخدمة مع الرسوم البيانية معدل النمو(الشكل التكميلي 1). تم تحقيق نسبة مناسبة إذا كانت الخلايا يمكن أن تنمو دون اهتزاز إضافي بعد حضانة قصيرة من كثافة أولية تبلغ حواليOD 600nm = 0.1. سوف تنقسم الخلايا في هذه المرحلة وفقا لدرجة حرارة البيئة فقط (3) تقييد حركة الخلية: حركة الخلية تعتمد بقوة على صلابة الركيزة (لوحة الآغاروز). يعتمد ثبات الركيزة على مقدار إجمالي الآغاروز ووقت التصلب الجلي. لا يمكن ترك المواد الهلامية لترسيخ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، كما القولونية Escherichia سيخضع الانقسام. وتشمل العوامل الأخرى التي تؤثر على استقرار الركيزة كمية المياه في العينة والرطوبة. يتم مناقشة قضايا إضافية بالتفصيل في نتائج الممثل. يوفر هذا البروتوكول العديد من التفاصيل وينتقل تدريجيا من خطوة إلى أخرى. يوفر البروتوكول استقرار طويل لتجارب التصوير ويوفر أداة أساسية لمعالجة الصور.
في هذا العمل، قمنا بتطوير بروتوكول يمكن تتبع الكمبيوتر من الخلايا الحية الإشريكية القولونية، بعد مستويات الانقسام والفلورسنت على مدى فترة من الساعات. يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد الديناميكيات العشوائية للدوائر الجينية في الإشريكية القولونية من خلال قياس السيرة الذاتية وSNR ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر السيد جيل غيلبرت (كلية الهندسة الكهربائية، تكنيون) على مساعدته في قانون MATLAB. نشكر الدكتور Ximing لي (كلية الهندسة الطبية الحيوية ، Technion) للمساعدة في التدقيق في هذه المقالة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل مؤسسة عائلة نيوباور ووزارة العلوم الإسرائيلية، منحة 2027345.
35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
Bacto tryptone | BD – Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
Casamino acids | BD – Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
Yeast Extract | BD – Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |