Kwantificering van de inname van macronutriënten in een thermogenetisch neuronaal scherm met drosophilalarven
Summary
Hier wordt een protocol beschreven dat de colorimetrische kwantificering mogelijk maakt van de hoeveelheid voedsel die binnen een bepaald tijdsinterval wordt gegeten door Drosophila melanogasterlarven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. Deze assays worden uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch scherm.
Abstract
Foerageer- en voedingsgedrag stelt dieren in staat om toegang te krijgen tot energiebronnen en voedingsstoffen die essentieel zijn voor hun ontwikkeling, gezondheid en fitheid. Het onderzoeken van de neuronale regulatie van dit gedrag is essentieel voor het begrijpen van de fysiologische en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan nutritionele homeostase. Het gebruik van genetisch trekbare diermodellen zoals wormen, vliegen en vissen vergemakkelijkt dit soort studies aanzienlijk. In het afgelopen decennium is de fruitvlieg Drosophila melanogaster gebruikt als een krachtig diermodel door neurobiologen die de neuronale controle van voedings- en foerageergedrag onderzoeken. Hoewel ongetwijfeld waardevol, onderzoeken de meeste studies volwassen vliegen. Hier beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van het eenvoudigere larvale zenuwstelsel om neuronale substraten te onderzoeken die het voedingsgedrag controleren wanneer larven worden blootgesteld aan diëten die verschillen in hun eiwit- en koolhydraatgehalte. Onze methoden zijn gebaseerd op een kwantitatieve colorimetrische no-choice voedingstest, uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch activeringsscherm. Als uitlezing werd de hoeveelheid voedsel die door larven gedurende een interval van 1 uur werd gegeten, gebruikt bij blootstelling aan een van de drie diëten met een kleurstoflabel die verschillen in hun eiwit-koolhydratenverhoudingen (P:C). De werkzaamheid van dit protocol wordt aangetoond in de context van een neurogenetisch scherm in larvale Drosophila, door kandidaat-neuronale populaties te identificeren die de hoeveelheid voedsel reguleren die wordt gegeten in diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. We waren ook in staat om de geteste genotypen te classificeren en te groeperen in fenotypische klassen. Naast een korte bespreking van de momenteel beschikbare methoden in de literatuur, worden de voor- en nadelen van deze methoden besproken en worden ook enkele suggesties gedaan over hoe dit protocol kan worden aangepast aan andere specifieke experimenten.
Introduction
Alle dieren zijn afhankelijk van een uitgebalanceerd dieet om de nodige hoeveelheden voedingsstoffen te verkrijgen voor overleving, groei en voortplanting1. De keuze van wat en hoeveel te eten wordt beïnvloed door een veelheid aan interactiefactoren die verband houden met de interne toestand van het dier, zoals het verzadigingsniveau en omgevingsomstandigheden, zoals voedselkwaliteit2,3,4,5. Eiwitten en koolhydraten zijn twee belangrijke macronutriënten en de evenwichtige inname ervan is essentieel om de fysiologische processen van dieren te ondersteunen. Daarom is het begrip van de neurale mechanismen die het voedingsgedrag controleren en een evenwichtige inname van deze macronutriënten ondersteunen uiterst relevant. Dit komt omdat levensgeschiedeniskenmerken zoals levensduur, vruchtbaarheid en metabole gezondheid direct worden beïnvloed door de niveaus van eiwitinname6,7,8,9,10.
Het gebruik van eenvoudigere meer tracteerbare organismen die evolutionair geconserveerde voedingsgewoonten vertonen bij complexe dieren, waaronder zoogdieren, is essentieel voor dit soort studies. Belangrijk is dat deze eenvoudigere diermodellen een goede gelegenheid bieden om complexe biologische vragen te ontleden in een dure, ethische en technisch effectievere context. In de afgelopen decennia is Drosophila, met zijn krachtige genetische toolkit, ingewikkeld en stereotiep gedrag en geconserveerde architectuur van perifere en nutriëntendetectiemechanismen met zoogdieren, een vruchtbaar model geweest voor gedragsneurobiologen11. Uiteindelijk is de hoop dat door te begrijpen hoe voedselinname bij dit dier wordt gereguleerd, met een eenvoudiger zenuwstelsel, we dan kunnen beginnen met het ontwarren van neuronale storingen die ten grondslag liggen aan menselijke eetstoornissen.
De studie van neuronale substraten voor voedingsgedrag is sterk afhankelijk van het tegelijkertijd kunnen meten van de voedselinname van dieren terwijl ze hun neuronale activiteit manipuleren. Vanwege de minimale hoeveelheden voedsel die worden ingenomen, is het kwantificeren van de hoeveelheid voedsel die door vliegen wordt gegeten uiterst uitdagend en alle methoden die momenteel beschikbaar zijn, vertonen aanzienlijke beperkingen. De gouden standaard is dus het gebruik van een combinatie van complementaire methodologieën12. Volwassen vliegen zijn historisch begunstigd als een genetisch en gedragsmodel. Niettemin bieden Drosophila-larven ook mogelijkheden om neuronale substraten te onderzoeken die coderen voor voedingsgedrag. Het larvale centrale zenuwstelsel (CZS), met ongeveer 12.000 neuronen, is aanzienlijk minder complex dan dat van de volwassene, die ongeveer 150.000 neuronen bevat. Deze lagere complexiteit is niet alleen numeriek, maar ook functioneel, omdat larvaal gedrag afhankelijk is van eenvoudigere locomotieffuncties en sensorische systemen. Ondanks de schijnbare eenvoud van hun zenuwstelsel vertonen larven nog steeds volledig voedingsgedrag, en sommige methoden om voedselinname in Drosophila-larven te kwantificeren zijn beschreven5,13,14,15. Door te paren met manipulaties van neuronale activiteit, kunnen Drosophila-larven een zeer tracteerbaar model vormen voor het begrijpen van de neurale regulatie van voedselinname.
Hier is een gedetailleerd protocol beschikbaar om de voedselinname te kwantificeren bij larven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. De diëten, zogenaamde macronutriëntenbalanceringsdiëten, verschilden in de eiwit- en koolhydrateninhoud, met name met betrekking tot de eiwit-koolhydraatverhoudingen (P:C): 1:1 (eiwitrijk dieet), 1:4 (tussendieet) en 1:16 (eiwitarm dieet), zoals weergegeven in figuur 1A. Kortom, een kwantitatieve no-choice voedingstest werd vastgesteld met behulp van deze drie isocalorische sucrose-gist (SY) gebaseerde diëten geverfd met een blauwe voedselkleurstof. Omdat gistextract en sacharose werden gebruikt als eiwit- en koolhydraatbronnen en beide koolhydraten bevatten, werd variatie in de P:C-verhoudingen verkregen door de balans van deze twee componenten te veranderen, zoals eerder beschreven16 en zoals aangegeven in figuur 1B. Een schematisch overzicht van het protocol, met de belangrijkste experimentele stappen, is beschikbaar in figuur 2.
Dit protocol is opgesteld met als doel de rol van specifieke neuronale populaties te onderzoeken op de regulering van larvale voedingsniveaus in diëten met verschillende P:C-verhoudingen en in de context van een thermogenetisch neuronaal scherm. Een goed gekarakteriseerd neurogenetisch hulpmiddel werd gebruikt uit de Transient Receptor Potential (TRP) familie: Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), een temperatuur- en spanningsge gated cation kanaal, waardoor het afvuren van actiepotentiaal wanneer de omgevingstemperatuur boven 25 °C17stijgt. Om de dTRPA1 transgene uit te drukken, hebben we gebruik gemaakt van de Gal4-lijnen op basis van cis-regulerenderegio’s uit het Drosophila-genoom, gevestigd in het Rubin-laboratorium, in het kader van het FlyLight-project op Janelia Research Campus18,19.
Hoewel het protocol, hier beschreven, is vastgesteld in de context van een activeringsscherm, kan het door de experimenteerder gemakkelijk worden aangepast aan andere specifieke behoeften of interesses, namelijk om een onderdrukkingsscherm uit te voeren met behulp van de temperatuurgevoelige neuronale geluiddemper ShibireTS20, in alternatief voor dTRPA1. Deze en andere aanpassingen worden besproken in de protocol- en discussiesecties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met dit protocol zou men het vermogen van larven onder thermogenetische activering van specifieke neuronale populaties kunnen testen om de innameniveaus van eiwitten en koolhydraten, twee belangrijke macronutriënten, te reguleren wanneer ze worden blootgesteld aan diëten met verschillende P:C-samenstelling. Deze methode werd getest in de context van een larvale voorlopige screening met als doel neuronale populaties te identificeren die verband houden met de controle van voedselinname in verschillende diëten van versch…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen het Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC) bedanken voor het verlenen van toegang tot een deel van de experimentele apparatuur die in dit protocol wordt beschreven. Dit werk werd ondersteund door portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 en La Caixa HR17-00595 aan PMD en door een Australian Research Council Future Fellowship (FT170100259).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
| 10xPBS | Nytech | MB18201 | |
| 2.0 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
| 60 mm petri dishes | Greiner Bio-one, Austria | 628161 | |
| 96 well microplates | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
| Agar | Pró-vida, Portugal | ||
| Bench cooler | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
| Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
| Cell disruption media | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm glass beads) |
| Dish weight boats | Santa Cruz Biotechnology | SC-201606 | |
| Embryo collection cage for 60 mm petri dishes | Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK | FLY1212 (59-100) | |
| Featherweight forceps | BioQuip Products, USA | 4750 | |
| Fly food for stocks maintenance | 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid | ||
| Forceps #5 | Dumont | 0108-5-PS | Standard tips, INOX, 11cm |
| Incubator | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | For thermogenetic feeding assay (30∘C) |
| Incubator | Percival Scientific, USA | DR36NL | To stage larvae (19∘C) |
| Janelia lines | Janelia Research Campus | Detailed information in Table 2 | |
| Macronutrient balancing diets | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Methanol | VWR | CAS number: 67-56-1 | |
| Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Nitrile gloves | VWR, USA | ||
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | 5804 R / Serial number: 5805CI364293 | |
| Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center | |
| ShibireTS UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 66600 | Provided by Carlos Ribeiro Group |
| Soft brushes | For sorting anaesthetised fruit flies | ||
| Spectrophotometer plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
| Stereo microscope | Nikon | 1016625 | |
| Sucrose | Sidul, Portugal | ||
| Third-instar larvae (L3) rearing diet | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Timer | |||
| Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
| TRPA1 UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 26264 | Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C |
| Water bath | Sheldon Manufacturing Inc., USA | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
| Yeast extract | Pró-vida, Portugal | 51% Protein, 15% Carbohydrate |
Referências
- Raubenheimer, D. . Nature of nutrition – a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).
- Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. K. Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective. Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).
- Steck, K., et al. Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila. Elife. 7, 31625 (2018).
- Itskov, P. M., Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila. Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Levine, M. E., et al. Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population. Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).
- Solon-Biet, S. M., et al. The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice. Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).
- Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Jones, W. D. The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila. BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).
- Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target. Scientific Reports. 3, (2013).
- Schoofs, A., et al. Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain. PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).
- Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. Motor control of Drosophila courtship song. Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).
- Mirth, C. M. J. Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. Obesity: the protein leverage hypothesis. Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).
- Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates. Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).
- Li, H. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).
- Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).
- Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).
- Almeida-Carvalho, M. J., et al. The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).
- Rodrigues, M. A., et al. Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time. Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).
- Wu, Q., et al. Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system. Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster. Neurociência. 148 (2), 371-374 (2007).
