드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화
Summary
여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.
Abstract
먹이를 주고 먹이를 주는 행동을 통해 동물은 개발, 건강 및 피트니스에 필수적인 에너지와 영양소의 원천에 접근할 수 있습니다. 이러한 행동의 신경 조절을 조사하는 것은 영양 항상성의 근본적인 생리적 및 분자 메커니즘의 이해를 위해 필수적입니다. 벌레, 파리 및 물고기와 같은 유전적 인 동물 모델의 사용은 이러한 유형의 연구를 크게 용이하게합니다. 지난 10 년 동안, 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터는 먹이와 위조 행동의 신경 제어를 조사하는 신경 생물학자에 의해 강력한 동물 모델로 사용되었습니다. 의심 할 여지없이 가치가 있지만, 대부분의 연구는 성인 파리를 검사합니다. 여기서, 우리는 애벌레가 그들의 단백질과 탄수화물 함량이 다른 규정식에 드러날 때 먹이 행동을 통제하는 신경 기질을 조사하기 위하여 간단한 애벌레 신경계를 이용하는 프로토콜을 기술합니다. 우리의 방법은 뉴런 열유전학 활성화 스크린의 맥락에서 수행되는 정량적 색색 무선택 공급 분석법을 기반으로 합니다. 판독으로, 1 시간 간격을 통해 애벌레에 의해 먹는 음식의 양은 탄수화물 (P:C) 비율에 그들의 단백질에서 다른 3개의 염료 표지 규정식 의 한에 드러낼 때 이용되었습니다. 이 프로토콜의 효능은 다른 다량 영양소 품질의 식단에서 먹는 음식의 양을 조절하는 후보 신경 인구를 식별함으로써, 애벌레 Drosophila에서신경 유전학 화면의 맥락에서 입증된다. 우리는 또한 표현형으로 시험된 유전자형을 분류하고 그룹화할 수 있었습니다. 문헌에서 현재 사용 가능한 방법에 대한 간략한 검토 외에도 이러한 방법의 장점과 제한 사항이 논의되고 이 프로토콜이 다른 특정 실험에 어떻게 적응할 수 있는지에 대한 몇 가지 제안이 제공됩니다.
Introduction
모든 동물은 생존, 성장 및번식을위해 필요한 양의 영양소를 얻기 위해 균형 잡힌 식단에 의존합니다. 무엇을 얼마나 먹을지의 선택은 포만 수준과 같은 동물의 내부 상태와 관련된 다양한 상호 작용 요인및 식품 품질2,3,4,5와같은 환경 조건에 의해 영향을 받습니다. 단백질과 탄수화물은 두 가지 주요 다량 영양소이며 균형 잡힌 섭취는 동물의 생리적 과정을 유지하는 데 필수적입니다. 따라서, 먹이 행동을 통제하고 이러한 다량 영양소의 균형 잡힌 섭취를 유지하는 신경 메커니즘의 이해는 매우 관련이 있다. 이는 수명, 대변, 대사 건강 과 같은 생명력 특성이단백질 섭취량6,7,8,9,10의수준에 직접적으로 영향을 받고 있기 때문이다.
포유류를 포함한 복잡한 동물과 함께 진화적으로 보존된 먹이 습관을 나타내는 더 간단한 더 많은 기관 유기체의 사용은 이러한 유형의 연구에 필수적입니다. 중요한 것은, 이러한 간단한 동물 모델은 비용이 많이 드는, 윤리적, 기술적으로 더 효과적인 맥락에서 복잡한 생물학적 질문을 해부 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 지난 수십 년 동안, Drosophila는강력한 유전 도구 키트, 복잡하고 고정관적인 행동 및 포유류와 말초 및 영양 감지 메커니즘의 보존 된 아키텍처를 통해 행동 신경 생물학자11을위한유익한 모델이되었습니다. 궁극적으로, 희망은 음식 섭취가 이 동물에서 어떻게 규제되는지 이해함으로써, 더 간단한 신경계로, 우리는 인간 섭식 장애의 근본적인 신경 오작동을 풀어 놓기 시작할 수 있다는 것입니다.
먹이 행동에 대 한 신경 기판의 연구는 그들의 신경 활동을 조작 하는 동안 동시에 동물의 음식 섭취를 측정 할 수 있는에 깊이 의존. 섭취하는 음식의 최소한의 양으로 인해 파리가 먹는 음식의 양을 정량화하는 것은 매우 어렵고 현재 사용 가능한 모든 방법은 상당한 한계를 제시합니다. 따라서, 금본위제는 상호 보완적인방법론(12)의조합을 사용하는 것입니다. 성인 파리는 역사적으로 유전 및 행동 모델로 선호되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, Drosophila 애벌레, 또한 먹이 행동을 코딩 하는 신경 기판을 조사 하는 기회를 제공. 약 12,000개의 뉴런을 가진 애벌레 중추 신경계 (CNS)는 대략 150,000개의 뉴런을 포함하는 성인의 그것 보다는 현저하게 더 적게 복잡합니다. 이 낮은 복잡성은 수치뿐만 아니라 기능적입니다, 유라 행동은 간단한 기관차 기능과 감각 시스템에 의존하기 때문에. 그들의 신경계의 명백한 단순성에도 불구하고, 애벌레는 아직도 완전한 먹이 행동을 전시하고, Drosophila 애벌레에 있는 음식 섭취를 정량화하는 몇몇 방법은5,13,14,15를기술되었습니다. 신경 활동의 조작과 짝을 이면, Drosophila 애벌레는 음식 섭취의 신경 조절을 이해하기 위한 고도의 기관모형을 구성할 수 있습니다.
여기에 제공 된 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 노출 된 애벌레의 음식 섭취량을 정량화하는 상세한 프로토콜이 있습니다. 이른바 다량영양소 균형 식단은 단백질과 탄수화물 함량이 다르며, 특히 탄수화물(P:C) 비율에 대한 단백질과 관련하여 1:1(단백질이 풍부한 식단), 1:4(중간 식단), 1:16(단백질 가난한 식단)에 대해 도 1A에나타낸 바와 같이. 간단히 말해서, 청색 식품 염료로 염색한 이 3개의 동종 자당 효모(SY)를 사용하여 정량적 무선택 수유 분석이 설립되었습니다. 효모 추출물과 자당은 단백질 및 탄수화물 공급원으로 사용되었고, 둘 다 탄수화물을 함유하고 있기 때문에, P:C 비율의 변이는 이전에 설명된 바와 같이, 이 두 성분의 균형을 변경하여 얻어졌다16 및 도 1B에나타난 바와 같이. 주요 실험 단계를 보여주는 프로토콜의 회로도 개요는 그림 2에서사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 다른 P:C 비율의 규정식에 있는 애벌레 공급 수준의 규칙에 특정 신경 인구의 역할을 조사하고 열유전학 신경 스크린의 맥락에서 설치되었습니다. 잘 특징적인 신경유전학 적 도구는 과도 수용체 전위 (TRP) 제품군에서 사용되었다: 드로소필라 과도 수용체 잠재적 채널 (dTRPA1), 이는 온도 및 전압 게이트 양이온 채널입니다, 주변 온도가 25 ° C17이상 상승 할 때 행동 잠재력의 발사를 허용. dTRPA1 트랜스진을 표현하기 위해, 우리는 Janelia 연구 캠퍼스18,19에서플라이 라이트 프로젝트의 맥락에서 루빈 실험실에 설립 된 드로소필라 게놈에서 시스– 규제 영역을 기반으로 Gal4 라인을 이용했다.
여기서 설명된 프로토콜은 활성화 화면의 맥락에서 확립되었지만, dTRPA1의 대안으로, 온도에 민감한 뉴런 소음기 ShibireTS20을사용하여 억제 스크린을 수행하기 위해, 즉 다른 특정 요구 또는 관심사에 실험자가 쉽게 적응할 수 있다. 이 및 기타 적응은 프로토콜 및 토론 섹션에서 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜을 사용하면 특정 신경 인구의 열유전학 활성화하에서 유충의 능력을 테스트하여 단백질과 탄수화물의 섭취 수준을 조절할 수 있으며, 두 가지 주요 다량 영양소가 다른 P:C 조성물의 식단에 노출될 수 있습니다. 이 방법은 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 걸쳐 음식 섭취량의 제어와 관련된 신경 인구를 식별하는 것을 목표로 애벌레 예비 검진의 맥락에서 테스트되었다. 이 작품?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜에 설명된 실험 장비의 일부에 대한 액세스를 제공한 Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC)에 감사드립니다. 이 작품은 포르투갈 과학기술재단(FCT), 리스보아-01-0145-FEDER-007660에 의해 지원되었다. PTDC/NEU-NMC/2459/2014, IF/00697/2014, 라 카이사 HR17-00595 ~ PMD, 호주 연구위원회 미래 펠로우십(FT170100259)이 CKM에 있습니다.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
| 10xPBS | Nytech | MB18201 | |
| 2.0 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
| 60 mm petri dishes | Greiner Bio-one, Austria | 628161 | |
| 96 well microplates | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
| Agar | Pró-vida, Portugal | ||
| Bench cooler | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
| Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
| Cell disruption media | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm glass beads) |
| Dish weight boats | Santa Cruz Biotechnology | SC-201606 | |
| Embryo collection cage for 60 mm petri dishes | Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK | FLY1212 (59-100) | |
| Featherweight forceps | BioQuip Products, USA | 4750 | |
| Fly food for stocks maintenance | 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid | ||
| Forceps #5 | Dumont | 0108-5-PS | Standard tips, INOX, 11cm |
| Incubator | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | For thermogenetic feeding assay (30∘C) |
| Incubator | Percival Scientific, USA | DR36NL | To stage larvae (19∘C) |
| Janelia lines | Janelia Research Campus | Detailed information in Table 2 | |
| Macronutrient balancing diets | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Methanol | VWR | CAS number: 67-56-1 | |
| Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Nitrile gloves | VWR, USA | ||
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | 5804 R / Serial number: 5805CI364293 | |
| Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center | |
| ShibireTS UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 66600 | Provided by Carlos Ribeiro Group |
| Soft brushes | For sorting anaesthetised fruit flies | ||
| Spectrophotometer plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
| Stereo microscope | Nikon | 1016625 | |
| Sucrose | Sidul, Portugal | ||
| Third-instar larvae (L3) rearing diet | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Timer | |||
| Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
| TRPA1 UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 26264 | Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C |
| Water bath | Sheldon Manufacturing Inc., USA | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
| Yeast extract | Pró-vida, Portugal | 51% Protein, 15% Carbohydrate |
Referências
- Raubenheimer, D. . Nature of nutrition – a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).
- Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. K. Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective. Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).
- Steck, K., et al. Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila. Elife. 7, 31625 (2018).
- Itskov, P. M., Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila. Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Levine, M. E., et al. Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population. Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).
- Solon-Biet, S. M., et al. The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice. Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).
- Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Jones, W. D. The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila. BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).
- Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target. Scientific Reports. 3, (2013).
- Schoofs, A., et al. Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain. PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).
- Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. Motor control of Drosophila courtship song. Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).
- Mirth, C. M. J. Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. Obesity: the protein leverage hypothesis. Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).
- Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates. Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).
- Li, H. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).
- Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).
- Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).
- Almeida-Carvalho, M. J., et al. The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).
- Rodrigues, M. A., et al. Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time. Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).
- Wu, Q., et al. Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system. Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster. Neurociência. 148 (2), 371-374 (2007).
