Avaliação quantitativa de PCR em tempo real de expressões de microRNA no rim do rato com obstrução ureteral unilateral

Resumo

Descrevemos um método para avaliar a expressão de microRNA nos rins de camundongos com obstrução ureteral unilateral (UUO) por reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa. Este protocolo é adequado para estudar perfis de expressão de microRNA renal em camundongos com UUO e no contexto de outras condições patológicas.

Resumo

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA não codificadas e não codificadas que normalmente regulam a expressão genética no nível pós-transcricional, vinculando-se a locais-alvo parcialmente complementares na região não traduzida (UTR) de RNA mensageiro (mRNA), o que reduz a tradução e estabilidade do mRNA. Os perfis de expressão miRNA em vários órgãos e tecidos de camundongos foram investigados, mas métodos padrão para a purificação e quantificação do miRNA no rim de camundongos não estão disponíveis. Estabelecemos um método eficaz e confiável para extrair e avaliar a expressão miRNA no rim do rato com fibrose intersticial renal por reação quantitativa de cadeia de polimerase de transcrição reversa (qRT-PCR). O protocolo exigia cinco etapas: (1) criação de camundongos de obstrução ureteral falsa e unilateral (UUO); (2) extração de amostras de rins dos camundongos UUO; (3) extração do RNA total, que inclui miRNA, a partir das amostras de rim; (4) síntese complementar de DNA (cDNA) com transcrição reversa do miRNA; e (5) qRT-PCR utilizando o cDNA. Usando este protocolo, confirmamos com sucesso que, em comparação com os controles, a expressão de miRNA-3070-3p foi significativamente aumentada e as de miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p foram significativamente diminuídas nos rins de um modelo de camundongo de fibrose interstícia renal. Este protocolo pode ser usado para determinar a expressão miRNA nos rins de camundongos com UUO.

Introdução

MicroRNAs (miRNAs) — os RNAs curtos e não codificados que causam a degradação e inibição transcricional do RNA mensageiro (mRNA)¹ — têm mostrado regular a expressão de vários mRNAs que têm papéis cruciais tanto na fisiologia quanto na doença (por exemplo, inflamação, fibrose, distúrbios metabólicos e câncer). Alguns dos miRNAs podem, portanto, ser novos biomarcadores candidatos e alvos terapêuticos para uma variedade de doenças^2,3,,4,5. Embora os perfis de expressão do miRNA em órgãos e tecidos do camundongo, incluind....

Protocolo

Todos os protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Jichi Medical University e foram realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Guia da Universidade Médica jichi para animais de laboratório.

1. A falsa cirurgia

1. Prepare os seguintes itens: isoflurane, folha de cortiça, creme depilatório, lenços umedecidos de laboratório, placa de Petri com soro fisco tamponado de fosfato (PBS), 4-0 nylon, pinças, tesoura cirúrgica, cotonetes de algodão e camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade.
2. Anestesiar um rato com isoflurane de 1,5% e manter-se em 1,....

Resultados

Um modelo de rato UUO foi criado por ligadura ureteral esquerda, como descrito²¹ em camundongos machos de 8 semanas de idade pesando 20-25 g. Os ureteres foram completamente obstruídos por ligadura dupla com suturas de seda 4-0. Um analgésico (meloxicam 5 mg/kg, injeção subcutânea) foi administrado antes da cirurgia e também diariamente nos 2 dias pós-cirurgia. Aos 8 dias após a cirurgia, foram coletados rins, enxaguados com PBS, dissecados e armazenados em nitrogênio líquido para análise posterio.......

Discussão

O protocolo acima descrito com qRT-PCR determinou com sucesso os níveis de expressão dos miRNAs direcionados. A avaliação das miRNAs extraídas é importante na busca de obter dados significativos de qRT-PCR, e a fim de confirmar a qualidade dos miRNAs antes de realizar o qRT-PCR, a razão de absorção em 260 nm para que em 280 nm deve ser verificada com um espectótmetro. Se uma única amplificação pcr do comprimento esperado e temperatura de fusão ou uma curva de fusão monomodal não pode ser obtida por qRT-PCR, pode haver co.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Qiagen	79216	Tampão de lavagem 2
Qiagen	1067933	Tampão de lavagem 1
Tokyo Laboratory Animals Science	Não atribuído
Thermo Fisher Scientific	4316813	placa
Thermo Fisher Scientific	4311971	Filme adesivo para placa
de reação de 96 poçosQiagen	MS00001701	5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
	MS00065141	5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3'Qiagen
	MS00068067	5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen
	MS00068081	5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
	217004	Rotação ancorada por membrana coluna em um tubo de coleta de 2,0 mL
		Instrumento de PCR em tempo real
	Rolamento 9968-32

de reação de 96 poços Qiagen 218161 Kit de transcriptase reversa Qiagen 218073 Kit de PCR à base de corante verde Qiagen 79654 Colunas de rotação de biopolímero em um tubo de coleta de 2,0 mL Qiagen 79306 Reagente de lise à base de fenol/guanidina Thermo Fisher Scientific 4472380 Thermo Fisher Scientific 4472380 Software de instrumento de PCR em tempo real Qiagen 129112 Qiagen MS00033740 Não divulgado Takara Bio 9790B Homogeneizador de silício ASKUL GA04SW COMO UM ER1004NA45-KF2,62 -