الكشف عن فيتفتورا capsici في مياه الري باستخدام Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة
Summary
قمنا بتطوير طريقة للكشف عن Phytophthora capsici zoospores في مصادر المياه باستخدام طريقة استخراج الحمض النووي ورقة مرشح إلى جانب تضخيم متساوي الحراري حلقة بوساطة (مصباح) التي يمكن تحليلها في الميدان أو في المختبر.
Abstract
فيتفدورا capsici هو مسبب الأمراض oomycete المدمرة التي تؤثر على العديد من المحاصيل سولاناسيس و cucurbit الهامة مما تسبب خسائر اقتصادية كبيرة في إنتاج الخضروات سنويا. فيتفدورا capsici هو التربة التي تنقلها ومشكلة مستمرة في حقول الخضروات بسبب هياكلها البقاء على قيد الحياة طويلة (oospores وchlamydospores) التي تقاوم التجوية والتدهور. الطريقة الرئيسية للتشتت هي من خلال إنتاج جراثيم حدائق الحيوان ، وهي جراثيم ذات خلية واحدة ، ذات اسلافية يمكن أن تسبح من خلال أفلام رقيقة من الماء الموجود على الأسطح أو في مسام التربة المليئة بالماء ويمكن أن تتراكم في البرك والبرك. ولذلك، يمكن أن تكون أحواض الري مصدرا للأمراض والنقاط الأولية لتفشي الأمراض. الكشف عن P. capsici في مياه الري من الصعب استخدام الأساليب التقليدية القائمة على الثقافة لأن الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة في البيئة، مثل Pythium spp.، وعادة ما تكون مفرطة P. capsici مما يجعلها غير قابلة للكشف. لتحديد وجود جراثيم P. capsici في مصادر المياه (مياه الري ، الجريان السطحي ، وما إلى ذلك) ، قمنا بتطوير ورقة تصفية يدوية تعتمد على المضخة (8-10 ميكرومتر) تلتقط جراثيم العامل الممرض (جراثيم حدائق الحيوان) وتستخدم لاحقًا لتضخيم الحمض النووي للممرض من خلال مكبرات ايزومترية (مصباح) جديدة بوساطة حلقة مصممة لتضخيم P. capsici محددة. يمكن لهذه الطريقة تضخيم وكشف الحمض النووي من تركيز منخفض يصل إلى 1.2 × 102 zoospores /mL ، وهو أكثر حساسية 40 مرة من PCR التقليدية. ولم يتم الحصول على أي تضخيم عبري عند اختبار الأنواع ذات الصلة الوثيقة. كما تم تنفيذ مصباح باستخدام صبغة المزيج الرئيسي مصباح colorimetric، وعرض النتائج التي يمكن قراءتها بالعين المجردة للكشف السريع في الموقع. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع مسببات الأمراض الأخرى التي تقيم أو تتراكم أو تتوزع عبر شبكات الري الملوثة.
Introduction
أصبحت إعادة تدوير المياه في المزارع والحضانات شعبية متزايدة بسبب زيادة تكاليف المياه والمخاوف البيئية وراء استخدام المياه. وقد تم تطوير العديد من طرق الري للمزارعين للحد من انتشار وانتشار الأمراض النباتية. بغض النظر عن مصدر المياه (الري أو هطول الأمطار)، يتم توليد الجريان السطحي، والعديد من مزارعي الخضروات والحضانة لديها بركة لجمع وإعادة تدوير الجريانالسطحي 1. وهذا يخلق خزانا لتراكم مسببات الأمراض المحتملة لصالح انتشار مسببات الأمراض عند استخدام المياه المعاد تدويرها لري المحاصيل2,3,4. Oomycete النباتات المسببة للأمراض تستفيد بشكل خاص من هذه الممارسة كما سوف تتراكم جراثيم حدائق الحيوان في الماء وspore تشتت الأولية هو الذاتي motile ولكن يتطلب المياه السطحية5،6،7. Phytophthora capsici هو مسببات الأمراض oomycete التي تؤثر على عدد كبير من المحاصيل سولاناسيس و cucurbit بطرق مختلفة8. في كثير من الأحيان، والأعراض هي التخميد قبالة الشتلات، الجذر وتعفن التاج. ومع ذلك، في المحاصيل مثل الخيار، الاسكواش، البطيخ، اليقطين، البطيخ والباذنجان والفلفل، قد تضيع المحاصيل بأكملها بسبب تعفن الفاكهة9. على الرغم من أن هناك طرق معروفة للكشف عن هذا النبات الممرض، ومعظم تتطلب العدوى قد وقعت بالفعل الذي تأخر جدا بالنسبة لأي فطريات وقائية أن يكون لها تأثير كبير10.
الطريقة التقليدية لاختبار مياه الري للكشف عن وتشخيص الكائنات الدقيقة المستهدفة هو نهج عتيق عندما السرعة والحساسية حاسمة للنجاح وإنتاج المحاصيل مربحة11,12. النسيج النباتي المعرض لمسببات الأمراض المستهدفة (على سبيل المثال، الباذنجان لP. capsici)تعلق على فخ المعدلة التي يتم تعليقها في بركة الري لفترة طويلة قبل إزالتها وتفتيشها للعدوى. ثم يتم وضع عينات من الأنسجة النباتية على وسائط شبه انتقائية (PARPH) ومحتضنة لنمو الثقافة ، ثم يتم تنفيذ تحديد المورفولوجية باستخدام مجهر مركب13. هناك طرق أخرى مماثلة للكشف عن مسببات الأمراض النباتية الأخرى باستخدام وسائل الإعلام انتقائية والطلاء كميات صغيرة من المياه الملوثة قبل زراعة الفرعية14،15. هذه الأساليب تتطلب في أي مكان من 2 إلى 6 أسابيع، عدة جولات من الزرع الفرعي لعزل الكائن الحي، والخبرة في تشخيص Phytophthora لتكون قادرة على التعرف على الشخصيات المورفولوجية الرئيسية لكل نوع. هذه الطرق التقليدية لا تعمل بشكل جيد للكشف عن مياه الري الملوثة بp. capsici بسبب عوامل مثل التدخل من قبل الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة أيضا في مصادر المياه. بعض الكائنات الحية الدقيقة سريعة النمو مثل Pythium SPP. والبكتيريا التي تنقلها المياه يمكن أن تتزايد على لوحة مما يجعل P. capsici غير قابل للكشف16,17.
وكان الغرض من هذه الدراسة هو تطوير طريقة جزيئية حساسة ومحددة يمكن استخدامها في كل من البيئات الميدانية والمختبرية للكشف عن جراثيم حدائق الحيوان P. capsici في مياه الري. ويتضمن البروتوكول تطوير رواية حلقة بوساطة التضخيم متساوي الحراري (مصباح) التمهيدي مجموعة قادرة على تضخيم على وجه التحديد P. capsici, استنادا إلى 1121 قاعدة زوج (bp) جزء من P. capsici18,19. تم استخدام التمهيدي مصباح وضعت سابقا من دونغ وآخرون (2015) بالمقارنة مع الفحص الذي تم تطويره لهذه الدراسة20.
إن مقايسة المصباح هي شكل جديد نسبيًا من أشكال الكشف الجزيئي الذي ثبت أنه أكثر سرعة وحساسية وتحديداً من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR)21. وبصفة عامة، لا يمكن لم مقايسات PCR التقليدية الكشف عن أقل من 500 نسخة (1.25 pg/μL)؛ في المقابل، وقد أظهرت الدراسات السابقة أن حساسية مصباح يمكن أن يكون 10 إلى 1000 مرة أعلى من PCR التقليدية ويمكن بسهولة الكشف عن 1 fg/μL من الحمض النوويالجينومي 22،23. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء الفحص بسرعة (غالباً في 30 دقيقة) وفي الموقع (في الحقل) باستخدام كتلة التدفئة المحمولة للتضخيم وصبغة colorimetric التي تغير لون لعينة إيجابية (إزالة الحاجة إلى الكهرباء). في هذه الدراسة، قارنا حساسية المقايسات PCR و LAMP باستخدام طريقة استخراج المرشح. طريقة الكشف المقترحة تسمح للباحثين وعوامل الإرشاد للكشف بسهولة عن وجود جراثيم P. capsici من مصادر المياه المختلفة في أقل من ساعتين. وقد ثبت أن الفحص أكثر حساسية من PCR التقليدية وتم التحقق من صحتها في الموقع عن طريق الكشف عن وجود العامل الممرض في مياه الري المستخدمة من قبل المزارع. وستتيح طريقة الكشف هذه للمزارعين تقدير وجود العامل الممرض وكثافته السكانية في مختلف مصادر المياه المستخدمة في الري، مما يمنع حدوث فاشيات مدمرة وخسائر اقتصادية.
Protocol
Representative Results
Discussion
اختبار مياه الري لل phytopathogens هو خطوة حاسمة للمزارعين باستخدام أحواض الري والمياه المعاد تدويرها27. توفر أحواض الري خزاناً وأرضاً خصبة لعدد من الباتات النباتية حيث يتم توجيه مياه الري الزائدة من الحقل إلى البركة التي تحمل معها أي مسببات الأمراض التي قد تكون موجودة16</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تلقى هذا العمل الدعم المالي من لجنة جورجيا للسلع للخضروات المشروع ID # FP00016659. يشكر المؤلفون الدكتور بينغشينغ جي، جامعة جورجيا والدكتورة آن دورانس، جامعة ولاية أوهايو لتقديمها ثقافات نقية من فيتوفاهورا SPP. كما نشكر لي وانغ وديلوريس فيني على مساعدتهما التقنية طوال فترة الدراسة.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
